| Analysis of Phagosomal Antigen Degradation by Flow Organellocytometry
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Author:
Date:
2016-11-20
[Abstract] Professional phagocytes internalize self and non-self particles by phagocytosis to initiate innate immune responses. After internalization, the formed phagosome matures through fusion and fission events with endosomes and lysosomes to obtain a more acidic, oxidative and hydrolytic environment for the degradation of its cargo. Interestingly, phagosome maturation kinetics differ between cell types and cell activation states. This protocol allows to quantify phagosome maturation kinetics on a single organelle level in different types of phagocytes using flow cytometry. Here, ovalbumin ...
[摘要] 专业吞噬细胞通过吞噬作用内化自身和非自身颗粒以启动先天免疫应答。内化后，形成的吞噬体通过与内体和溶酶体的融合和裂变事件成熟，以获得更酸性，氧化和水解的环境用于其货物的降解。有趣的是，吞噬体成熟动力学在细胞类型和细胞活化状态之间不同。该协议允许使用流式细胞术定量不同类型的吞噬细胞中单个细胞器水平上的吞噬体成熟动力学。在这里，卵白蛋白（OVA）耦合的颗粒用作吞噬作用模型系统在树突状细胞（DC），其通过吞噬内化。在不同的时间点之后，吞噬体成熟参数，例如OVA的吞噬体降解和溶酶体蛋白（例如LAMP-1）的获得，可以通过流式细胞器细胞计数以高度定量的方式同时测量。这些读出可以与其他吞噬体功能相关，例如抗原降解，在DC中的加工和负载。
[背景] ...
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| Evaluation of Cross-presentation in Bone Marrow-derived Dendritic Cells in vitro and Splenic Dendritic Cells ex vivo Using Antigen-coated Beads
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Author:
Date:
2016-11-20
[Abstract] Antigen presentation by MHC class I molecules, also referred to as cross-presentation, elicits cytotoxic immune responses. In particular, dendritic cells (DC) are the most proficient cross-presenting cells, since they have developed unique means to control phagocytic and degradative pathways.
This protocol allows the evaluation of antigen cross-presentation both in vitro (by using bone marrow-derived DC) and ex vivo (by purifying CD8+ DC from spleen after incorporation of particulate antigen) using ovalbumin (OVA)-coupled particles. Cross-presentation ...
[摘要] 通过MHC I类分子的抗原呈递，也称为交叉呈递，引起细胞毒性免疫应答。特别地，树突细胞（DC）是最熟练的交叉呈递细胞，因为它们已经开发了控制吞噬和降解途径的独特手段。 <此协议允许在体外（通过使用骨髓衍生的DC）和离体（通过纯化CD8 + ）评价抗原交叉呈递。 （OVA）偶联的颗粒后，来自脾脏的DC/DC结合颗粒抗原）。通过三种不同的读数测量交叉呈递效率：B3Z杂交瘤T细胞系（Karttunen等人，1992）和抗原特异性CD8 + T细胞的刺激OT-I）（Kurts等人，1996），在用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记它们之后分析CD69表达或OT-I增殖的OT-I活化。通过使用这种方法，我们可以最近显示DCs能够在TLR4结合时瞬时增加交叉表达效率（Alloatti等人，2015）。 [背景] 在小鼠中，抗原呈递细胞（APC）能够吸收外源抗原以加工它们，并将源自这些外源抗原的肽加载到主要组织相容性复合体（MHC）I类分子上。肽-MHC I复合物随后被转运到质膜，在那里它们可以呈递到CD8 + T细胞，从而促进T细胞活化，这被称为交叉呈递（Joffre等人， al 。，2012）。在不同的APC中，树突状细胞（DC）在交叉呈递方面表现优异，并且包含表达XCR1标记的不同亚群，其已经显示非常有效地交叉呈递抗原（即CD8 + 来自脾的DC和来自皮肤和肺的CD103 ...
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