| Single Molecule RNA FISH in Arabidopsis Root Cells
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Methods that allow the study of gene expression regulation are continually advancing. Here, we present an in situ hybridization protocol capable of detecting individual mRNA molecules in plant root cells, thus permitting the accurate quantification and localization of mRNA within fixed samples (Duncan et al., 2016; Rosa et al., 2016). This single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) uses multiple single-labelled oligonucleotide probes to bind target RNAs and generate diffraction-limited signals that can be detected using a wide-field ...
[摘要] 允许研究基因表达调控的方法不断前进。在这里，我们提出了一种能够检测植物根细胞中单个mRNA分子的原位杂交方案，从而允许mRNA在固定样品内的准确定量和定位（Duncan等人， ，2016; Rosa等人，2016）。这种单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）使用多个单标记寡核苷酸探针结合靶RNA并产生可以使用宽场荧光显微镜检测的衍射限制信号。我们调整了该方法的最新版本，该方法使用48个荧光标记的DNA寡核苷酸（20个）与每个转录物的不同部分杂交（Raj等人，2008）。这种方法简单易行，具有很好的应用于任何遗传背景的优点。
虽然已经开发了单分子FISH来定量测量培养细胞，组织切片和整体无脊椎动物生物体的单细胞水平的mRNA，但该方法未被优化用于植物中的单细胞。由于植物组织的内源性自发荧光，植物中的荧光成像是相当有挑战性的。在这里，我们报告一种检测植物中单RNA分子的方法。我们描述在固定的拟南芥根瘤胃细胞内的单一转录物的检测和自动计数。该方法产生隔离的单元和单细胞层，其与红色和远红色染料一起使用可以最大化限制背景噪声的信噪比。
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| Assessment of Cellular Redox State Using NAD(P)H Fluorescence Intensity and Lifetime
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Author:
Date:
2017-01-20
[Abstract] NADH and NADPH are redox cofactors, primarily involved in catabolic and anabolic metabolic processes respectively. In addition, NADPH plays an important role in cellular antioxidant defence. In live cells and tissues, the intensity of their spectrally-identical autofluorescence, termed NAD(P)H, can be used to probe the mitochondrial redox state, while their distinct enzyme-binding characteristics can be used to separate their relative contributions to the total NAD(P)H intensity using fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). These protocols allow differences in metabolism to be ...
[摘要] NADH和NADPH分别是分解代谢和合成代谢过程的氧化还原辅因子。此外，NADPH在细胞抗氧化防御中起着重要作用。在活细胞和组织中，其光谱相同的自发荧光（称为NAD（P）H）的强度可用于探测线粒体氧化还原状态，而其不同的酶结合特征可用于将其相对贡献与总共分离使用荧光寿命成像显微镜（FLIM）的NAD（P）H强度。这些方案允许在细胞类型和改变的生理和病理状态之间检测代谢的差异。
背景 氧化还原辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）及其磷酸化对应物NADPH的还原形式本质上是荧光的，两者都吸收波长为340（±30）nm并在460（±50）nm处发射的光（Patterson等人。，2000）。这些光谱特征在氧化成NAD（上标+）或NADP（superson），（2007））时损失。单独的NAD和NADP池的氧化还原平衡决定了对比的代谢过程（Ying，2008），如图1所示。NAD作为电子受体，用于通过三羧酸氧化线粒体中的糖，脂质和氨基酸底物（TCA）循环，并作为内线粒体膜（IMM）上的电子传递链（ETC）的电子供体，促使将质子泵送到膜间隙中，作为合成三磷酸腺苷（ATP）的电源，通过F 1 F 0 O 3 ATP合成酶（Osellame等人，2012）。因此，线粒体中NADH与NAD + 的平衡反映了TCA循环与ETC活性的平衡。 ...
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