| Generation of microRNA Sponge Library
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] This protocol describes the generation and functional validation of microRNA (miRNA) sponge or decoy constructs. When expressed from a strong promoter, these transcripts can sequester specific miRNA:RISC complexes, thereby resulting in a derepression of endogenous target mRNA. Hence, cells expressing such sponges display a partial or full miRNA loss-of-function phenotype.
Depending on the sponge sequence, the activity of any miRNA of choice can be inhibited by sponge sequestration, but it should be noted that these constructs do not seem to be specific for one particular miRNA. ...
[摘要] 该协议描述了microRNA（miRNA）海绵或诱饵构建体的产生和功能验证。 当从强启动子表达时，这些转录物可以隔离特定的miRNA：RISC复合物，从而导致内源性靶mRNA的去阻遏。 因此，表达这种海绵的细胞表现出部分或完全的miRNA功能丧失表型。
根据海绵序列的不同，所选择的miRNA的活性可以通过海绵螯合来抑制，但是应该指出，这些构建体对于一种特定的miRNA似乎并不是特异性的。 相反，由种子序列定义的同一家族的所有miRNA将受到影响，尽管程度不同。
【背景】微小RNA（miRNA）是短的非编码RNA，其大小约为21-24个核苷酸，其在转录后沉默哺乳动物中所有蛋白质编码基因的大部分。自从他们发现以来，越来越多的研究已经清楚地将这个监管层确定为几乎所有生理过程的关键要素。在这种情况下并不奇怪，miRNA的异常表达也与几种人类恶性肿瘤包括癌症有因果关系。
使用经典的功能增益方法，早期研究通常利用过表达来评估特定miRNA的功能。然而，与生理环境相比，这可以达到高达100倍或更高的miRNA水平，并且可能产生不一定与miRNA的正常功能相关的表型。
为了避免可能的过度表达伪影的这个显而易见的问题，在过去几年中已经开发了用于体内和体内使用的miRNA抑制的几种技术，从而允许分析一种特定的miRNA或一组miRNA以功能丧失的方式。这些包括例如miRNA诱饵或海绵的表达，通过以序列特异性方式隔离miRNA：RISC复合物来干扰miRNA功能的长转录物（Ebert等人。 ...
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| Generation of Caenorhabditis elegans Transgenic Animals by DNA Microinjection
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] Microinjection is the most frequently used tool for genetic transformation of the nematode Caenorhabditis elegans, facilitating the transgenic expression of genes, genome editing by the clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 system, or transcription of dsRNA for RNA intereference (RNAi). Exogenous DNA is delivered into the developing oocytes in the germline of adult hermaphrodites, which then generate transgenic animals among their offspring. In this protocol, we describe the microinjection procedure and the subsequent selection of transgenic progeny.
[摘要] 显微注射是线虫秀丽隐杆线虫遗传转化中最常用的工具，促进基因的转基因表达，通过聚集的定期散布的短回文重复序列（CRISPR）-Cas9系统的基因组编辑或转录 dsRNA用于RNA干扰（RNAi）。 外源DNA被递送到成年雌雄同株的种系中的发育中的卵母细胞中，然后在它们的后代中产生转基因动物。 在该方案中，我们描述了显微注射程序和随后的转基因后代选择。
【背景】在C.通过显微注射的DNA转化通常用于产生过表达或异位表达可以与标签（例如，绿色荧光蛋白[GFP]）融合的基因的转基因动物，允许突变体的表型拯救和/或蛋白质的定位和功能的分析（Carter等人，1990; Chalfie等人，1994; Mello和Fire，1995）。聚集的定期散布的短回文重复（CRISPR）-Cas9系统的出现需要显微注射以通过引入点突变或插入/缺失突变来实现高度特异性的基因组编辑（概述于Dickinson和Goldstein，2016）。此外，该技术被应用于dsRNA的可诱导和/或组织特异性转录以便于遗传性RNA干扰（RNAi）（Tavernarakis等人，2000） ...
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| P-body and Stress Granule Quantification in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2017-01-20
[Abstract] Eukaryotic cells contain various types of cytoplasmic, non-membrane bound ribonucleoprotein (RNP) granules that consist of non-translating mRNAs and a versatile set of associated proteins. One prominent type of RNP granules is Processing bodies (P bodies), which majorly harbors translationally inactive mRNAs and an array of proteins mediating mRNA degradation, translational repression and cellular mRNA transport (Sheth and Parker, 2003). Another type of RNP granules, the stress granules (SGs), majorly contain mRNAs associated with translation initiation factors and are formed upon ...
[摘要] 真核细胞含有各种类型的细胞质，非膜结合的核糖核蛋白（RNP）颗粒，其由非翻译mRNA和多种相关蛋白组成。一种突出类型的RNP颗粒是加工体（P体），其主要包含翻译失活的mRNA和介导mRNA降解，翻译抑制和细胞mRNA运输的蛋白质阵列（Sheth和Parker，2003）。另一种类型的RNP颗粒，应激颗粒（SGs）主要含有与翻译起始因子相关的mRNA并且在应激诱导的翻译失速（Kedersha等人，2000和1999）中形成。从单细胞生物学研究中获得的多个证据支持了一种模型，其中P体和SG在细胞应激期间物理相互作用以将mRNA转运，转移，临时储存或折返到翻译中（Anderson和Kedersha，2008; Decker和Parker，2012）。 P体和/或SG的量化，分布和共定位是研究RNP颗粒的组成及其对基础细胞过程（如压力反应和翻译调节）的贡献的重要工具。在这个协议中，我们描述了一种量化线虫秀丽隐杆线虫体细胞中P体和SGs的方法。
背景 到目前为止，研究P体和SG的大多数方案是针对酵母或人类细胞系开发的（Buchan et al。，2010）。对多细胞生物体内的体细胞RNP颗粒的功能知之甚少。简单的模型生物体。线虫已广泛用于研究与P体和SG不同的种系特异性P颗粒，以及种系发育和功能的重要结构（Updike和Strome，2010）。虽然所提出的方法的原理可以应用于计数种系特异性P颗粒，但该方案集中于体细胞RNP颗粒的定量。几项研究已经确定了在C中通过miRNA途径的翻译失调的体细胞P体的保守功能。 ...
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