| Production, Purification and Characterization of Recombinant Biotinylated Phytochrome B for Extracellular Optogenetics
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] In the field of extracellular optogenetics, photoreceptors are applied outside of cells to obtain systems with a desired functionality. Among the diverse applied photoreceptors, phytochromes are the only ones that can be actively and reversibly switched between the active and inactive photostate by the illumination with cell-compatible red and far-red light. In this protocol, we describe the production of a biotinylated variant of the photosensory domain of A. thaliana phytochrome B (PhyB-AviTag) in E. coli with a single, optimized expression plasmid. We give detailed ...
[摘要] [摘要 ] 在细胞外光遗传学领域，光感受器被应用于细胞外，以获得具有所需功能的系统。在各种应用的感光体中，植物色素是唯一可以通过与细胞相容的红色和远红外光照射而在活性和非活性光态之间主动和可逆地切换的色素。在此协议中，我们描述了在大肠杆菌中拟南芥光敏色素B（PhyB-AviTag ）的光敏域的生物素化变体的生产。 带有一个优化的表达质粒。我们给出了通过固定的金属亲和色谱法纯化蛋白质的详细说明，并根据纯度，生物素化，光谱光开关以及与它的相互作用伴侣PIF6的光依赖性相互作用对蛋白质进行了表征。与以前使用PhyB-AviTag 进行的研究相比，此方案中使用的优化表达质粒简化了生产过程，并显示出更高的产量和纯度。
[背景 ] 在新兴的细胞外光遗传学领域，光感受器被应用于细胞外，例如，以控制生物功能或设计光响应性生物材料（Leung 等，2008；Zhang 等，2015；Chen and Wegner ，2017 ; Lyu 等人，2017 ; Wang 等人，2017 ; Bartelt 等人，2018 ; Beyer 等人，2018a ; Beyer 等人，2018b ; Jia 等人，2018 ; Kolar 等人， 2018 ; Liu 等人，2018 ; Wu 等人，2018 ; Baaske 等人，2019 ; Gil 等人，2019 ; H?rner ...
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| Construction and Cloning of Minigenes for in vivo Analysis of Potential Splice Mutations
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Date:
2018-03-05
[Abstract] Disease-associated mutations influencing mRNA splicing are referred to as splice mutations. The majority of splice mutations are found on exon-intron boundaries defining canonical donor and acceptor splice sites. However, mutations in the coding region (exonic mutations) can also affect mRNA splicing. Exact knowledge of the disease mechanism of splice mutations is essential for developing optimal treatment strategies. Given the large number of disease-associated mutations thus far identified, there is an unmet need for methods to systematically analyze the effects of pathogenic mutations on ...
[摘要] 影响mRNA剪接的疾病相关突变称为剪接突变。大多数剪接突变位于确定典型供体和受体剪接位点的外显子 - 内含子边界上。然而，编码区中的突变（外显子突变）也可影响mRNA剪接。准确了解剪接突变的疾病机制对于开发最佳治疗策略至关重要。鉴于迄今为止鉴定的大量疾病相关突变，尚未满足对系统分析致病突变对mRNA剪接的影响的方法的需求。由于不同细胞类型之间的拼接可能不同，如果可能的话，拼接突变需要在天然条件下进行测试。一种常用的分析mRNA剪接的工具是携带外显子和内含子序列的小基因的构建。在这里，我们描述了设计和克隆到重组腺相关病毒（rAAV）载体中用于基因递送和在本地环境中调查mRNA剪接的方案。该协议是为了基于小基因的视网膜细胞中mRNA剪接分析而开发的，但是原则上它适用于任何可以用rAAV载体转导的细胞类型。
【背景】预计大部分疾病相关突变（至少15％）会导致异常的mRNA剪接（Cartegni等，2002; Singh和Cooper，2012; Sterne-Weiler和Sanford，2014年）。 '经典'剪接突变是影响定义5'和3'剪接位点（分别为供体和受体剪接位点）的规范序列的突变。然而，剪接突变也可能发生在其他非编码区和编码区（Wang和Cooper，2007; ...
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| Isolation of Ustilago bromivora Strains from Infected Spikelets through Spore Recovery and Germination
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Date:
2017-07-20
[Abstract] Ustilago bromivora is a biotrophic smut fungus infecting Brachypodium sp. It is closely related to the barley-infecting smut Ustilago hordei, and related to the well-studied, gall-inducing model pathogen Ustilago maydis. Upon flowering, the spikelets of U. bromivora-infected plants are filled with black fungal spores. While it is possible to directly use this spore material to infect Brachypodium seeds, in many cases it is more useful to isolate individual strains of U. bromivora for a genetically homogenous population. This ...
[摘要] Ustilago bromivora 是感染Brachypodium sp的生物营养性真菌真菌。 它与大麦感染黑斑病大西洋黑格尔（Hstilago hordei）密切相关，并且与研究良好的胆汁诱导型模型病原体Ustilago maydis有关。 开花时，U的小穗 受感染的植物充满黑色真菌孢子。 虽然可以直接使用这种孢子材料感染种子，但是在许多情况下，分离个体U株更有用。 bromivora 用于遗传上均匀的群体。 该协议描述了如何收集和发芽的U孢子。 溴代，以获得源自单细胞的菌株。
【背景】长期以来，感染玉米的Ustilago maydis已经被确定为用于研究生物营养性病原体的模型系统（Brefort等人，2009）。这导致了关于生物相互作用的性质的许多发现，但由于在实验室中与玉米的实际困难而受到限制。对于感染大麦（Hordeum vulgare ）（Laurie等人，2012）的模型真菌Ustilago hordei也是如此。与这些作物植物相反，模式草（Brachypodium distachyon）具有小的基因组，不成熟的生长条件，并且易于遗传操作（Draper等人，2001）。 B中。 distachyon 也被用于研究非对虾对小麦条锈菌的抗性。 SP。由于其通常的宿主，小麦（An 等人，2016）的遗传复杂性，小麦具有。最近，我们已经描述了Ustilago ...
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