| Identification of Intrinsic RNA Binding Specificity of Purified Proteins by in vitro RNA Immunoprecipitation (vitRIP)
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Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] RNA-protein interactions are often mediated by dedicated canonical RNA binding domains. However, interactions through non-canonical domains with unknown specificity are increasingly observed, raising the question how RNA targets are recognized. Knowledge of the intrinsic RNA binding specificity contributes to the understanding of target selectivity and function of an individual protein.
The presented in vitro RNA immunoprecipitation assay (vitRIP) uncovers intrinsic RNA binding specificities of isolated proteins using the total cellular RNA pool as a library. Total RNA extracted ...
[摘要] [摘要] RNA-蛋白质相互作用通常由专门的规范RNA结合域介导。然而，越来越多地观察到通过具有未知特异性的非经典结构域的相互作用，这提出了如何识别RNA靶标的问题。内在的RNA结合特异性的知识有助于理解单个蛋白质的靶标选择性和功能。
所呈现的体外RNA免疫沉淀测定法（vitRIP ）揭示固有RNA使用总细胞RNA池作为分离的蛋白质的结合特异性一个库。从细胞或组织中提取的总RNA与纯化的重组蛋白孵育，免疫沉淀RNA-蛋白复合物，并通过深度测序或定量RT-PCR鉴定结合的转录物。这些RNA中丰富的RNA类和核苷酸频率决定了重组蛋白的固有特异性。该简单而通用的方案可适用于任何细胞类型或组织的其他RNA结合蛋白和总RNA文库。
图形摘要：
图1.体外RNA免疫沉淀（vitRIP ）方案示意图
[背景]真核细胞包含许多不同的RNA类，具有成千上万的RNA种类以及与之相互作用的高度多样化的蛋白质。根据结合的RNA序列或结构的定义以及相互作用中涉及的蛋白质结构域的不同，RNA-蛋白质相互作用可分为特异性和非特异性（Jankowsky和Harris，2015）。越来越多地观察到通过未知特异性的非经典RNA结合结构域进行的RNA相互作用，这提出了如何识别专用RNA靶标的问题。 ...
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| Active Cdk5 Immunoprecipitation and Kinase Assay
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] Cdk5 activity is regulated by the amounts of two activator proteins, p35 and p39 (Tsai et al., 1994; Zheng et al., 1998; Humbert et al., 2000). The p35-Cdk5 and p39-Cdk5 complexes have differing sensitivity to salt and detergent concentrations (Hisanaga and Saito, 2003; Sato et al., 2007; Yamada et al., 2007; Asada et al., 2008). Cdk5 activation can be directly measured by immunoprecipitation of Cdk5 with its bound activator, followed by a Cdk5 kinase assay. In this protocol, buffers for cell lysis and immunoprecipitation are intended to ...
[摘要] Cdk5活性受两种激活蛋白p35和p39（Tsai et al。，1994; Zheng et al。，1998; Humbert等人）的量的调节，2000）。 p35-Cdk5和p39-Cdk5复合物对盐和洗涤剂浓度的敏感性不同（Hisanaga和Saito，2003; Sato et al。，2007; Yamada等人， 2007; Asada 等人，2008）。 Cdk5激活可以通过Cdk5与其结合的激活剂的免疫沉淀直接测量，随后进行Cdk5激酶测定。在该方案中，用于细胞裂解和免疫沉淀的缓冲液旨在保持p35-和p39-Cdk5复合物以评估总Cdk5活性。裂解细胞，并在核后上清液中测定蛋白浓度。 Cdk5在实验组之间从等量的总蛋白免疫沉淀。然后进行洗涤以除去外来蛋白质并平衡激酶缓冲液中的Cdk5-活化剂复合物。然后将Cdk5与组蛋白H1孵育，组蛋白H1是Cdk5和[γ- 32 P] ATP在体外成功建立的靶标。反应通过SDS-PAGE解析并转移到膜上，用于可视化H1磷酸化和免疫沉淀的Cdk5水平的免疫印迹。我们已经使用该测定来建立p39作为少突神经胶质谱系中Cdk5的主要活化剂。然而，该测定法适用于对裂解条件进行适当调整的其它细胞谱系或组织。
【背景】虽然Cdk5通常与神经元功能相关，但最近的工作已经证明Cdk5也可以调节少突胶质细胞祖细胞（OPC）的发育（Tang等人，1998; ...
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| Flow Cytometric Analysis of HIV-1 Transcriptional Activity in Response to shRNA Knockdown in A2 and A72 J-Lat Cell Lines
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] The main obstacle to eradicating HIV-1 from patients is post-integration latency (Finzi et al., 1999). Antiretroviral treatments target only actively replicating virus, while latent infections that have low or no transcriptional activity remain untreated (Sedaghat et al., 2007). To eliminate viral reservoirs, one strategy focuses on reversing HIV-1 latency via ‘shock and kill’ (Deeks, 2012). The basis of this strategy is to overcome the molecular mechanisms of HIV-1 latency by therapeutically inducing viral gene and protein expression under antiretroviral therapy and to ...
[摘要] 消除HIV-1患者的主要障碍是后整合延迟（Finzi等人，1999）。抗逆转录病毒治疗仅针对主动复制病毒，而具有低转录活性或无转录活性的潜伏感染仍未得到治疗（Sedaghat等人，2007）。为了消除病毒性水库，一项战略重点是通过“休克和杀死”来逆转HIV-1潜伏期（Deeks，2012）。该策略的基础是通过在抗逆转录病毒治疗下通过治疗性诱导病毒基因和蛋白质表达来克服HIV-1潜伏期的分子机制，并通过病毒的溶解性质或现在识别感染细胞的免疫系统引起选择性细胞死亡。最近，许多研究已经描述了药物抑制人类溴结构域蛋白质的溴结构域和末端（BET）家族的成员的治疗潜力（Filippakopoulos等人，2010; Dawson等人＆ / em>，2011; Delmore等人，2011），其包括BRD2，BRB3，BRD4和BRDT。小分子BET抑制剂，例如JQ1（Filippakopoulos et al。，2010; Delmore等人，2011），I-BET（Nicodeme等人＆lt; / ...
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