| Fluorescent Measurement of Synaptic Activity Using FM Dyes in Dissociated Hippocampal Cultured Neurons
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Release and recycling of synaptic vesicles are essential for neurotransmission and synaptic plasticity. To gain mechanistic understanding of these processes, direct measurements of vesicle release and retrieval is indispensable. Styryl dyes like FM1-43 and FM4-64 have been widely used for this purpose and their loading and unloading are reliable measurements for synaptic vesicle release and retrieval in cultured neurons. This protocol describes in detail the procedure of using styryl dyes to label and measure synaptic vesicle uptake and release in cultured rat hippocampal neurons. We also ...
[摘要] 突触小泡的释放和再循环对于神经传递和突触可塑性是至关重要的。 为了获得对这些过程的机械理解，直接测量囊泡释放和回收是必不可少的。 苯乙烯基染料如FM1-43和FM4-64已被广泛用于此目的，其装载和卸载是可靠的测量突触小泡释放和恢复培养的神经元。 该协议详细描述了使用苯乙烯基染料来标记和测量培养的大鼠海马神经元中的突触小泡摄取和释放的程序。 我们还包括对海马文化的简要描述。 最后，我们简要讨论FM染料，pH敏感荧光蛋白和量子点在测量突触小泡行为方面的共性和差异。
【背景】突触小泡是神经传递不可或缺的，因为它们是化学突触中负责神经递质释放的唯一细胞器。它们的数量，释放概率，融合动力学和再循环路线定义了突触传递和神经元交流。已经开发了多种用于探测突触囊泡的工具，包括突触后神经元的电生理学记录，膜运输的电容测量，可氧化的发射体的电流分析，固定突触的电子显微镜成像以及活神经元中的囊泡标记的荧光成像。在所有现有的方法中，最后一个是不仅产生关于个体突触的空间和时间信息，而且提供高吞吐量（即，来自不同神经元的单个突触的更多数据点）的唯一方法。已经开发了基于不同定向和报告机制的各种荧光探针。二十多年前发明的苯乙烯基染料（即FM染料，包括FM1-43，FM4-64，FM5-95）仍然是一种可靠而方便的工具。由于其对脂质膜的中等亲和力及其对脂质敏感的排放，可以容易地装载到再循环的突触囊泡中并且当这些囊泡被胞吐出时释放。使用更敏感的光电探测器如EMCCD，FM染料可以报告单个囊泡释放事件。在这里，我们提供了一个相对完整的基于FM的啮齿动物海马神经元原代培养的突触小泡释放成像的描述。此外，我们还讨论了FM染料和其他荧光泡标签的共性和区别。 ...
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| Protocol for Murine/Mouse Platelets Isolation and Their Reintroduction in vivo
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Author:
Date:
2017-02-20
[Abstract] Platelets and coagulation have long been known to be essential for metastasis in experimental models. In order to study the interactions between tumor cells, platelets and endothelium, we have adapted methods used in coagulation research for the isolation of platelets and their reintroduction into mice. Anti-coagulated murine blood served as the source for platelets. Platelets were separated from other elements of the whole blood by centrifugation. Here the critical elements are first inhibition of coagulation and second isolation and maintenance of the platelets in the presence of inhibitors ...
[摘要] 长期以来，已知血小板和凝血酶在实验模型中对转移至关重要。为了研究肿瘤细胞，血小板和内皮之间的相互作用，我们采用了凝血研究中用于分离血小板及其再引入小鼠的适应方法。抗凝血鼠血液作为血小板的来源。通过离心将血小板与全血的其它元素分离。这里的关键因素是在存在血小板活化抑制剂的情况下首先抑制凝血和血小板的第二次分离和维持。然后用生物染料PKH26荧光标记血小板。这些标记血小板的输注允许显微观察引入的血小板。重新引入后，这些血小板看起来正常起作用，占总血小板的约50％。因为它们是荧光标记的，所以它们很容易被识别。最后，可以使用这些方法通过使用来自基因工程小鼠的血小板来确定改变的基因表达在血小板中的特异性效应。这些方法有助于研究组织培养和鼠模型中血小板和肿瘤细胞之间的相互作用。它们也适用于视频显微镜。在这里，我们提供了我们用于小鼠血小板分离的方法的细节，以及它们的染色用于进一步的显微镜和重新引入小鼠。
背景 已知血小板对于转移是必需的，而且在肿瘤生长期间也起作用，更不用说凝块形成。为了容易识别和追踪血小板，我们开发了荧光标记和再灌注血小板的手段。这使得它们可以容易地在不需要免疫染色的组织中鉴定。使用这些方法，我们显示肿瘤细胞和血小板之间的相互作用在转移早期在肿瘤细胞的存活中起关键作用（Im等人，2004; ...
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