| A Detailed Protocol for Large-scale Recombinant Expression and Validation of Human FGFR2 with Its Transmembrane and Extracellular Domains in Escherichia coli
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Author:
Date:
2019-06-05
[Abstract] Receptor tyrosine kinases (RTKs) are an important class of transmembrane receptors that mediate some of the most crucial biochemical pathways essential to the growth, differentiation, and survival of a cell and thus, are highly involved in cancers. Due to the complexity of RTKs having biochemically different domains including a transmembrane domain, an intact crystal structure of any of these proteins remain elusive as it is difficult to produce milligram amounts of intact functional RTKs for crystallography studies. A heavily studied RTK is fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2), which ...
[摘要] 受体酪氨酸激酶(RTKs)是一类重要的跨膜受体，介导细胞生长、分化和生存所必需的一些最关键的生化途径，因此，与癌症密切相关。由于RTKs具有包括跨膜结构域在内的不同生物化学结构域的复杂性，这些蛋白的完整晶体结构仍然难以获得，因为很难产生毫克数量的完整功能RTKs用于晶体学研究。一个被广泛研究的RTK是成纤维细胞生长因子受体2 (FGFR2)，它在成纤维细胞生长调控、分化和肿瘤发生中起着关键作用。以前的研究主要集中在单独表达FGFR2的细胞外、跨膜和细胞内结构域。对于该方案，我们主要关注FGFR2蛋白的细胞外和跨膜结构域。表达蛋白的功能是通过证明其结合肝素和成纤维细胞生长因子1 (FGF1)的能力来验证的。我们的协议的主要贡献是共同表达两个RTK域，包括跨膜域，以毫克为单位。能够表达RTKs以确定其晶体结构将使药理学家能够设计出选择性靶向活性构象的抗癌药物。
【背景】在寻找完整的、功能齐全的晶体结构的过程中，科学家们一直未能找到酪氨酸受体激酶。总的来说，跨膜蛋白的结构研究一直面临着很大的挑战，尤其是在表达大量的全功能蛋白方面。虽然大多数FGFR表达的研究都集中在细胞外受体或酪氨酸激酶域的单独结晶上，但与这两个域之一相关的跨膜结构域的工作可能导致多种生化挑战(Mohammadi et al.， 1996;Plotnikov et al.， 1999;普罗特尼科夫，等。， ...
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| Expression and Purification of Cyanobacterial Circadian Clock Protein KaiC and Determination of Its Auto-phosphatase Activity
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Author:
Date:
2017-02-20
[Abstract] Circadian rhythms are biological processes displaying an endogenous oscillation with a period of ~24 h. They allow organisms to anticipate and get prepared for the environmental changes caused mainly by the rotation of Earth. Circadian rhythms are driven by circadian clocks that consist of proteins, DNA, and/or RNA. Circadian clocks of cyanobacteria are the simplest and one of the best studied models. They contain the three clock proteins KaiA, KaiB, and KaiC which can be used for in vitro reconstitution experiments and determination of the auto-phosphatase activity of KaiC as ...
[摘要] 昼夜节律是显示内源性振荡的生物过程，周期为〜24小时。它们允许生物体预期并准备好主要由地球旋转引起的环境变化。昼夜节律由由蛋白质，DNA和/或RNA组成的昼夜节律钟驱动。蓝藻的昼夜节律时钟是最简单的研究模型之一。它们含有三种时钟蛋白质KaiA，KaiB和KaiC，其可用于体外重组实验和本方案所述的KaiC的自磷酸酶活性的测定。
背景 行星地球的旋转导致〜24小时的昼夜振荡。为了适应并有效地利用环境的这种节奏变化，大多数（如果不是全部）生物体具有约24小时的内源性活动节律，这被称为昼夜节律。昼夜节律为这些生物提供进化优势。昼夜节律的长期破坏是非常有害的（Ma et al。，2013）。在人类中，包括癌症，高血压和睡眠障碍在内的许多疾病与昼夜节律紊乱密切相关（Shi等人，2013; Roenneberg和Merrow，2016）。
＆nbsp;昼夜节律由称为昼夜节律钟的内生节律发生器控制。功能性昼夜节律钟具有三个功能：接受环境信息，将环境提示转变为振荡信号，并将这些信号转发到下游调制器（Pattanayak和Rust，2014）。蓝细菌是具有良好研究的昼夜节律钟的最简单的生物体，其中振荡发生器由三种蛋白质控制：KaiA，KaiB和KaiC（Mackey等人，2011; Johnson＆amp; et al。 ...
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