| Multiplexed GuideRNA-expression to Efficiently Mutagenize Multiple Loci in Arabidopsis by CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Since the discovery of the CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated protein (Cas) as an efficient tool for genome editing in plants (Li et al., 2013; Shan et al., 2013; Nekrasov et al., 2013), a large variety of applications, such as gene knock-out, knock-in or transcriptional regulation, has been published. So far, the generation of multiple mutants in plants involved tedious crossing or mutagenesis followed by time-consuming screening of huge populations and the use of the Cas9-system appeared a promising method to overcome ...
[摘要] 自从发现CRISPR（聚集的定期交织的短回文重复） - 相关蛋白（Cas）作为植物基因组编辑的有效工具（Li等人，2013; Shan等人已经出版了诸如基因敲除，敲入或转录调控等各种各样的应用，例如，2013; Nekrasov等人，2013）。到目前为止，植物中多种突变体的产生涉及繁琐的杂交或诱变，随后大量人群的耗时筛选，Cas9系统的使用似乎是有希望的方法来克服这些问题。我们设计了一种二元载体，其结合了在拟南芥UBIQUITIN10（UBQ10）启动子和引导RNA（gRNA）控制下的优化的化脓性链球菌（Caspase）密码子的编码序列）由 A驱动的表现盒。拟南芥U6 - 启动子，用于在拟南芥中进行有效的多重编辑（阎等人，2016年）。在这里，我们描述了一个逐步的方案，以经济有效的方式生成含有多个gRNA的二元载体和基于经典克隆方法的Cas9核酸酶。背景 RNA引导的Cas9系统源于针对外源DNA的细菌防御系统（Sorek等人，2013）。由于其高效率，易于处理和多重编辑的可能性，已经被认为是基因组编辑的选择方法。通常，Cas9基因编辑系统涉及单个合成RNA分子，其指导Cas9蛋白质靶向所需DNA位点以进行基因组修饰或转录控制的gRNA。 gRNA-Cas9复合物通过gRNA-DNA配对识别靶向的DNA，并需要存在原始相邻基序（PAM）。 ...
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| Conjugation of Duplexed siRNN Oligonucleotides with DD-HyNic Peptides for Cellular Delivery of RNAi Triggers
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Author:
Date:
2016-04-05
[Abstract] Despite the great promise that short interfering RNA (siRNA) induced RNAi responses hold as a therapeutic modality, due to their size (~15 kDa) and high negative charge (Bumcrot et al., 2006), siRNAs have no bioavailability and require a delivery agent to enter cells (Figure 1). TAT peptide transduction domain (PTD) has been developed as an agent that mediates cellular delivery of macromolecular therapeutics that otherwise lack bioavailability, making it a tantalizing candidate for siRNA delivery (Farkhani et al., 2014). Unfortunately, when conjugated to TAT PTD, the ...
[摘要] 尽管由于它们的大小（〜15kDa）和高负电荷（Bumcrot等人，2006），短干扰RNA（siRNA）诱导的RNAi反应保持作为治疗模式的巨大希望，siRNA没有生物利用度，需要递送剂进入细胞（图1）。 TAT肽转导结构域（PTD）已经被开发为介导大分子治疗剂的细胞递送的药剂，否则其缺乏生物利用度，使其成为siRNA递送的诱人候选物（Farkhani等人，2014）。不幸的是，当缀合到TAT PTD时，siRNA上40个负磷酸二酯主链电荷的存在中和了导致聚集和差的细胞递送的阳离子PTD（Meade和Dowdy，2007）。鉴于此，我们合成了称为siRibo核中性的中性RNAi触发物，用于与TAT PTD缀合（Meade等人，2014）。简言之，带负电荷的磷酸二酯主链通过具有生物可逆磷酸三酯保护基团的合成来中和，其通过细胞质限制性硫酯酶的作用特异性地转化为细胞内的带电磷酸二酯键，产生可诱导RNAi应答的野生型siRNA。在这里我们描述了与TAT PTD递送结构域（DD）HyNic肽的siRNN寡核苷酸的缀合和细胞递送。
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