| Gliding Assay to Analyze Microtubule-based Motor Protein Dynamics
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The purpose of this protocol is to provide an updated method of performing microtubule gliding assays and visualizing it using fluorescence microscopy.
[摘要] 该协议的目的是提供一种更新的微管滑翔测定方法，并使用荧光显微镜对其进行可视化。
有丝分裂主轴是主导有丝分裂的蛋白质机械。有丝分裂纺锤体利用基于微管的运动蛋白来组织自身，并施加力量驱动细胞分裂。基于微管的运动蛋白使用源自ATP水解的能量产生机械工作（Coppin等人，1997）。运动蛋白以单向方式转移微管。运动的行为可以通过体外滑行测定（Tao和Scholey，2010）来观察，其中将电机固定在玻璃表面上并提供微管和ATP。然后可以使用荧光显微镜研究运动蛋白的运动性，并且可以实时观察其动态行为的细节。该更新的方案将允许使用体外微管滑动测定法（Tao等人，2006和2016）分析基于微管的运动蛋白功能。
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| In vitro Microtubule Bundling Assay under Physiological Conditions
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Kinesins play a role in organizing the mitotic spindle through the crosslinking of microtubules (MTs), made possible through binding sites at opposite ends of the holoenzyme. Here, we developed a method to test kinesin MT crosslinking action under physiological conditions.
[摘要] 驱动蛋白通过微管（MT）的交联来组织有丝分裂纺锤体，通过在全酶的相对端的结合位点成为可能。在这里，我们开发了一种在生理条件下测试驱动蛋白MT交联作用的方法。
基于微管的运动蛋白是重要的，因为它们使用ATP的化学能产生力以便向量转移微管（MT）。在这些基于MT的运动蛋白中，称为驱动蛋白的超家族负责定向运输和沿微管的运动。一些运动蛋白在全酶的两端具有MT结合位点，因此它们可以在生理ATP条件下将MT交联成束（Tao等人，2006）。由于这种捆绑活动，它们在组织和维持有丝分裂纺锤体方面具有重要作用，其主要作用取决于其微管的极性模式（van den Wildenberg等人，2008）。以前的捆绑测定不包括ATP，或者使用可以产生人为结果的不可水解的ATP类似物。这里我们开发了一种使用生理ATP条件的方法。通过纯化这些全长运动蛋白，它使我们能够在生理条件下测定其交联活性。
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| Direct Visualization and Quantification of the Actin Nucleation and Elongation Events in vitro by TIRF Microscopy
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Author:
Date:
2017-03-05
[Abstract] Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool for visualizing the dynamics of actin filaments at single-filament resolution in vitro. Thanks to the development of various fluorescent probes, we can easily monitor all kinds of events associated with actin dynamics, including nucleation, elongation, bundling, fragmentation and monomer dissociation. Here we present a detailed protocol regarding the visualization and quantification of actin nucleation and filament elongation events by TIRF microscopy in vitro, which is based on the methods ...
[摘要] 全内反射荧光（TIRF）显微镜是用于在体外单丝分辨率下可视化肌动蛋白丝的动力学的强大工具。由于各种荧光探针的发展，我们可以轻松监测与肌动蛋白动力学相关的各种事件，包括成核，伸长，捆扎，碎裂和单体解离。在这里，我们提供了一个关于通过TIRF显微镜在体外可视化和定量肌动蛋白成核和细丝伸长事件的详细方案，其基于先前报道的方法（Liu等人， ，2015; Yang等人，2011）。
背景 ...
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