| Identification of Buffer Conditions for Optimal Thermostability and Solubility of Herpesviral Protein UL37 Using the Thermofluor Assay
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Structural and biochemical studies of proteins require high amounts of stable, purified proteins. Protein stability often depends on the buffer composition, which includes pH and concentration of salts or other solutes such as glycerol, hence an efficient method for identifying optimal buffer conditions for stability would minimize time and resources used for protein purification and further studies. This protocol describes the use of the Thermofluor assay, in combination with a custom 24-condition screen, to identify buffer conditions that increase protein thermostability, using the ...
[摘要] [摘要]蛋白质的结构和生化研究需要大量稳定、纯化的蛋白质。蛋白质的稳定性通常取决于缓冲液的组成，其中包括pH值和盐或其他溶质（如甘油）的浓度，因此，确定最佳缓冲液稳定性条件的有效方法可以将用于蛋白质纯化和进一步研究的时间和资源减至最少。本协议描述了使用热氟分析，结合自定义的24条件筛选，以确定缓冲条件，增加蛋白质热稳定性，使用保存的疱疹病毒蛋白UL37为例。详细说明了屏幕条件，运行Thermofluor的MATLAB脚本，并对数据进行了分析。与圆二色谱法（CD）相比，缓冲屏结合热荧光分析法为蛋白质热稳定性分析提供了一种快速、信息量大的方法。
[背景]蛋白UL37在疱疹病毒的生命周期中具有多种功能，是高效病毒复制所必需的。作为病毒膜的一个组成部分——夹在包含衣壳和脂质膜的基因组之间的一层——UL37不仅是病毒组装所必需的（Desai等人，2001年；Jambunathan等人，2014年），而且也是有效的衣壳运输（Leege等人，2009年）、神经入侵（Richards等人，2017年）和对抗宿主天然免疫应答（Liu等人，2008；Zhao等人，2016）。要更好地理解其多功能性的本质，就需要对其结构和生化特性有详细的了解，而这又需要性能良好的纯化蛋白质。
不同UL37结构体的初始制备在溶解度、单分散性和纯化蛋白的产率方面存在差异，使得蛋白制备不一致，进一步的表征也不可重现。由于缓冲优化是解决这些问题的直接方法，我们开发了一种24条件筛选法，可以改变缓冲剂、pH值以及NaCl和甘油的浓度，并将其与热氟分析法结合使用（Phillips等人，2011年），以确定最大限度提高热稳定性的缓冲条件。UL37的N端和C端具有可变的平均热稳定性和最佳缓冲条件（图1，表1）。然而，在所有情况下，提高蛋白质稳定性的条件也提高了蛋白质的溶解度，最终提高了纯化蛋白质的产量，从而促进了下游的生化特性。 ...
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| Isolation, Purification and Characterization of Exosomes from Fibroblast Cultures of Skeletal Muscle
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Exosomes are dynamic nanovesicles secreted by virtually all cells and are present in all biological fluids. Given their highly heterogeneous content exosomes have been implicated in many physiological and pathological processes that they exert by influencing cell-cell and cell-ECM communication. In recent years an increasing number of methods have been established for the purification and characterization of exosomes. These include ultracentrifugation, ultrafiltration, size exclusion chromatography, immune capture and precipitation using a proprietary polymer. Here, we provide a protocol ...
[摘要] [摘要 ] 外来体是几乎所有细胞分泌的动态纳米囊泡，并存在于所有生物体液中。鉴于它们的异质含量很高，外泌体已牵涉到它们通过影响细胞-细胞和细胞-ECM通讯而发挥的许多生理和病理过程。近年来，已经建立了越来越多的方法外泌体的纯化和表征。其中包括超速离心，超滤，尺寸排阻色谱，免疫捕获和使用专有聚合物的沉淀。在这里，我们提供了基于差分超速离心和蔗糖密度梯度的协议，该协议专门用于从成年小鼠骨骼肌衍生的原代成纤维细胞培养物中分离粗制和超纯外泌体。可以对该协议进行修改和修改，以从各种组织和体液中分离和表征外泌体。
背景 ] ë xosomes是单膜，异质纳米囊泡直径范围从30至150nm，secre 由所有细胞和存在于几乎所有的体液泰德。外泌体中存在的可溶性和膜大分子，mRNA，microRNA的光谱取决于代谢状态以及分泌这些纳米囊泡的细胞的发育起源。由于它们的货物组成，外泌体可以启动接收细胞中的信号传导途径，并参与了发育，免疫和正常组织生理的维持。在神经退行性疾病，纤维化和癌症等疾病条件下，它们被证明可以触发和传播病理刺激（Rackov 等，2018; Gurunathan 等，2019; van de Vlekkert 等，2019）。在这里，我们描述了从成年小鼠腓肠肌（GA）肌肉建立的成纤维细胞培养物中纯化外泌体的方案（van de Vlekkert ...
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| Method for CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Candida albicans
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] Candida albicans is the most prevalent and important human fungal pathogen. The advent of CRISPR as a means of gene editing has greatly facilitated genetic analysis in C. albicans. Here, we describe a detailed step-by-step procedure to construct and analyze C. albicans deletion mutants. This protocol uses plasmids that allow simple ligation of synthetic duplex 23mer guide oligodeoxynucleotides for high copy gRNA expression in C. albicans strains that express codon-optimized Cas9. This protocol allows isolation and characterization of deletion strains within ...
[摘要] 白色念珠菌是最普遍和最重要的人类真菌病原体。 CRISPR作为基因编辑手段的出现极大地促进了 C中的遗传分析。白色假丝酵母。 在这里，我们描述一个详细的分步过程来构建和分析 C。 白色念珠菌缺失突变体。 该协议使用质粒，允许合成的双链体23mer引导寡聚脱氧核苷酸在高拷贝gRNA表达的简单连接。 表达密码子优化的Cas9的白色念珠菌菌株。 该协议允许在9天内分离和鉴定缺失菌株。
【背景】℃。白色念珠菌是一种难以处理遗传的有机体。由于它通常作为不容易进行有性生殖的二倍体存在，所以纯合隐性突变需要对每个基因座进行连续修饰。克隆间规则间隔短回文重复（CRISPR）突变的发展和应用。白色念珠菌促进遗传操作，因为它允许两个等位基因同时突变（Vyas et al。，2015; Min et al。，2016; Ng and Dean，2017 ）。 CRISPR基因编辑涉及将RNA引导的核酸酶募集至邻近NGG原型间隔子邻接基序（PAM）的互补靶位点（Jinek等人，2012; Cong等人， 2013年;马里等人，2013年）。 CRISPR相关（Cas）核酸酶通过与结合Cas9的激活CRISPR RNA（tracrRNA）相关的指导RNA之间的互补碱基配对以高特异性进行靶向（Gasiunas等人， ...
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