| Identifying Protein Interactions with Histone Peptides Using Bio-layer Interferometry
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Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract] Histone post-translational modifications (PTMs) regulate numerous cellular processes, including gene transcription, cell division, and DNA damage repair. Most histone PTMs affect the recruitment or exclusion of reader proteins from chromatin. Here, we present a protocol to measure affinity and interaction kinetics between histone peptides and the recombinant protein using Bio-layer interferometry.
[摘要] 组蛋白翻译后修饰（PTM）调节许多细胞过程，包括基因转录，细胞分裂和DNA损伤修复。 大多数组蛋白PTM影响从染色质中募集或排除读取蛋白。 在这里，我们提出了一个协议，使用生物层干涉测量法测量组蛋白肽和重组蛋白之间的亲和力和相互作用动力学。
【背景】真核染色质结构大致分为常染色质和异染色质（Cheung和Lau，2005），异染色质结构根据组蛋白翻译后修饰（PTM）的组合进一步细分。这些PTM不仅改变染色质构象，还在基因表达和蛋白质募集中建立直接调节作用（Felsenfeld和Groudine，2003; Allshire和Madhani，2017）。组蛋白PTM的无数组合 - 包括乙酰化，磷酸化，甲基化，泛素化，生物素化，SUMO化和脯氨酸异构化，统称为“组蛋白标记” - 可以被发现，特别是在从核小体核心突出的非结构化N末端尾部（ Guetg和Santoro，2012）。这些PTM通过不同“读者”或效应蛋白的活动调节许多细胞过程，包括基因转录，细胞分裂和DNA损伤修复（Suganuma和Workman，2011）（Musselman et al。， 2012）。因此，已经做出很大努力来识别读者的组蛋白修饰。
使用常规方法（例如，表面等离子体共振[SPR]和SPR成像[SPRi]生物传感器）研究读取蛋白与其靶蛋白PTM之间的相互作用通常需要大量底物或复杂的多步实验方法并且由于各种方法特定的限制而变得复杂。这些问题排除了量化相互作用强度的简便性和准确性（Phizicky和Fields，1995; ...
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| Biochemical Analysis of Dimethyl Suberimidate-crosslinked Yeast Nucleosomes
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Nucleosomes are the fundamental unit of eukaryotic chromosome packaging, comprised of 147 bp of DNA wrapped around two molecules of each of the core histone proteins H2A, H2B, H3, and H4. Nucleosomes are symmetrical, with one axis of symmetry centered on the homodimeric interaction between the C-termini of the H3 molecules. To explore the functional consequences of nucleosome symmetry, we designed an obligate pair of H3 heterodimers, termed H3X and H3Y, allowing us to compare cells with single or double H3 alterations. Our biochemical validation of the heterodimeric X-Y interaction included ...
[摘要] 核小体是真核染色体包装的基本单元，由围绕核心组蛋白H2A，H2B，H3和H4中的每一个的两个分子包裹的147bp DNA组成。 核小体是对称的，一个对称轴以H3分子的C-末端之间的同源二聚体相互作用为中心。 为了探索核小体对称性的功能性后果，我们设计了一对特异性H3异二聚体，称为H3X和H3Y，使我们能够比较具有单一或双重H3改变的细胞。 我们对异二聚体X-Y相互作用的生物化学验证包括使用二甲基琥珀三酸酯（DMS）进行的核内H3交联。 在这里，我们提供了使用DMS来分析酵母核小体的详细方案。
【背景】组蛋白的翻译后修饰影响染色体生物学的各个方面，包括转录，复制，修复和重组。因为核小体包含每个核心组蛋白的两个拷贝，所以修饰可以是对称的（在两个H3尾部上的相同修饰，例如，在核小体内的两个H3尾部上的K27me（Voigt等人
对于单个核小体内H3X-H3Y相互作用的生化验证，我们生成了表达细菌生物素连接酶BirA，N-末端V5-标记的H3X和N-末端生物素接受表位标记的H3Y的酵母菌株（Beckett等人， 1999）。 ...
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| Biochemical Isolation of Myonuclei from Mouse Skeletal Muscle Tissue
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] Skeletal muscle provides the contractile force necessary for movement, swallowing, and breathing and, consequently, is necessary for survival. Skeletal muscle cells are unique in that they are extremely large cells containing thousands of nuclei. These nuclei must all work in concert to maintain skeletal muscle function and thereby maintain life. The nucleus is a major site of signaling integration and gene expression regulation. However, examining nuclear processes in skeletal muscle can be difficult because myonuclei are challenging to isolate. We optimized a protocol to purify myonuclei ...
[摘要] 骨骼肌提供运动，吞咽和呼吸所需的收缩力，因此是生存所必需的。骨骼肌细胞是独特的，因为它们是含有数千个核的极大细胞。这些细胞核必须协调一致才能维持骨骼肌功能，从而维持生命。细胞核是信号整合和基因表达调控的主要部位。然而，检查骨骼肌中的核过程可能是困难的，因为肌核难以分离。我们优化了一个协议，从整个肌肉组织使用超速离心蔗糖梯度来分离核分数的纯化肌细胞。我们将这些纯化的细胞核用于下游应用，包括流式细胞术和质谱。我们使用这种方法来比较年轻和老鼠后肢肌肉的肌细胞蛋白质组（Cutler等人，2017）。这个协议可能适用于分离myonuclei的各种下游分析，如流式细胞仪，显微镜，蛋白质印迹和蛋白质组学。
【背景】为了生存，必须保持适当的骨骼肌功能。这种维持的一个组成部分是根据细胞需要和环境线索调整基因表达。调节基因表达的核过程是调节细胞组成和行为的关键组成部分。然而，由于四个技术限制，涉及这些过程的肌细胞蛋白难以研究。首先，骨骼肌是致密的，紧密地填满了组织中超过60％的蛋白质的收缩性蛋白质（Deshmukh等人，2015; Cutler等人）。 ...
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