| Characterization of Protein Domain Function via in vitro DNA Shuffling
|
|
Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] We recently investigated the molecular events that drive evolution of the CTX-M-type β-lactamases by DNA shuffling of fragments of the blaCTX-M-14 and blaCTX-M-15 genes. Analysis of a total of 51 hybrid enzymes showed that enzymatic activity could be maintained in most cases, yet the enzymatically active hybrids were found to possess much fewer amino acid substitutions than the few hybrids that became inactive, suggesting that point mutations in the constructs rather than reshuffling of the fragments of the two target genes would more likely cause ...
[摘要] 我们最近研究了通过对CTX-M-14和EMX-M-14的片段进行DNA改组来驱动CTX-M型β-内酰胺酶进化的分子事件， bla CTX-M-15基因。 总共51种杂合酶的分析显示酶活性在大多数情况下可以保持，但是酶活性杂合体被发现比少数杂交体具有少得多的氨基酸取代，这表明构建体中的点突变而不是 两个靶基因片段的重新洗牌将更可能导致CTX-M活性的破坏。 确定了一些在介导酶活性中起重要作用的重要残基。 这些发现表明，DNA改组是一种有效的方法来鉴定和表征细菌蛋白质中的重要功能结构域。
【背景】DNA重组是一种自然过程，通过该过程，细菌之间交换遗传物质以增强环境压力下的生存适应性。几种杂交CTX-M-内酰胺酶（CTX-M-64，CTX-M-123，CTX-M-137和CTX-M-132）可能是由bla CTX-M-14和 bla CTX-M-15基因是世界上最常见的变异体，近年来已有报道（Nagano et al。 ，2009; Tian et al。，2014; He et al。，2015; Liu et。， 2015年）。在这些杂合酶中，包含CTX-M-15的N-和C-末端部分和CTX-M-14的中间片段的CTX-M-64显示出比其亲本原型更高的催化活性（He <等）。，2015）。
DNA改组是一种分子途径，被设计为通过PCR介导的两种靶基因的随机组合来模拟和加速进化过程（Crameri ...
|
|
|
| Single-step Precision Genome Editing in Yeast Using CRISPR-Cas9
|
|
Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Genome modification in budding yeast has been extremely successful largely due to its highly efficient homology-directed DNA repair machinery. Several methods for modifying the yeast genome have previously been described, many of them involving at least two-steps: insertion of a selectable marker and substitution of that marker for the intended modification. Here, we describe a CRISPR-Cas9 mediated genome editing protocol for modifying any yeast gene of interest (either essential or nonessential) in a single-step transformation without any selectable marker. In this system, the Cas9 nuclease ...
[摘要] 芽殖酵母中的基因组修饰已经非常成功，主要归功于其高度同源性的DNA修复机制。之前已经描述了几种用于修饰酵母基因组的方法，其中许多方法涉及至少两个步骤：插入选择标记并用该标记取代预期的修饰。在这里，我们描述了CRISPR-Cas9介导的基因组编辑方案，用于在没有任何选择标记的情况下在单步转化中修饰任何感兴趣的酵母基因（基本或非必需）。在该系统中，Cas9核酸酶在选择的基因座处产生双链断裂，这在酵母细胞中通常是致死的，而不管由于无效的非同源末端连接修复导致的靶基因座的重要性。该致死性通过使用源自PCR的修复模板的同源重组导致有效的修复。在涉及必需基因的情况下，用功能性等位基因编辑基因组病变的必要性作为额外的选择层。作为一个激励性的例子，我们描述了使用这种策略替代HEM2，一种必需的酵母基因，以及相应的人类直向同源物ALAD。
【背景】酿酒酵母（Baccharomyces cerevisiae，Baker's酵母）作为一种遗传易处理的生物体具有悠久的历史，并且有许多操作酵母基因组的方法。然而，直到最近，有必要应用选择以分离具有所需遗传改变的克隆（Kearse等人，2012; DiCarlo等人，2013; Lee等人，等，2015; ...
|
|
|
| Multiple Stepwise Gene Knockout Using CRISPR/Cas9 in Escherichia coli
|
|
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] With the recent implementation of the CRISPR/Cas9 technology as a standard tool for genome editing, laboratories all over the world are undergoing one of the biggest advancements in molecular biology since PCR. The key advantage of this method is its simplicity and universal applicability for species of any phylum. Of particular interest is the extensively studied Gram-negative bacterium Escherichia coli, as it is considered as the workhorse for both research and industrial purposes. Here, we present a simple, robust and effective protocol using the CRISPR/Cas9 system in combination ...
[摘要] 随着CRISPR / Cas9技术作为基因组编辑的标准工具的最近实施，全世界的实验室正在经历PCR以来分子生物学方面最大的进步之一。这种方法的关键优点是其简单和普遍适用于任何物种的门。特别感兴趣的是广泛研究的革兰氏阴性细菌大肠杆菌，因为它被认为是研究和工业用途的主力。在这里，我们提出了一个简单，强大和有效的协议，使用CRISPR / Cas9系统结合λ红色基因敲除机器。大肠杆菌。在我们的程序中最重要的是使用双链供体DNA和固化策略来去除导向RNA编码质粒，其允许在仅仅两个工作日后开始新的突变。我们的方案允许多个具有高诱变效率的基因敲除株，适用于高通量的方法。
【背景】革兰氏阴性细菌大肠杆菌是生物技术工程中最重要的生物之一。已在能源，农业，食品生产，生物技术，医药等不同行业的各种流程中成功实施。由于不断的技术进步，生物技术部门正在迅速发展。特别是，CRISPR / Cas9技术可能是PCR（分子）生物学最大的革命（Ledford，2015）。简而言之，CRISPR / Cas9保护细菌免受诸如质粒和病毒等侵入性遗传因子的影响（Marraffini，2015）。利用这种从原核生物获得的免疫系统，已经开发了基于CRISPR / Cas9系统的基因组编辑的非常有力的工具（Jinek等人，2012）。
CRISPR / ...
|
|
|