| Coupling Exonuclease Digestion with Selective Chemical Labeling for Base-resolution Mapping of 5-Hydroxymethylcytosine in Genomic DNA
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] This protocol is designed to obtain base-resolution information on the level of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in CpGs without the need for bisulfite modification. It relies on (i) the capture of hydroxymethylated sequences by a procedure known as ‘selective chemical labeling’ (see Szulwach et al., 2012) and (ii) the digestion of the captured DNA by exonucleases. After Illumina sequencing of the digested DNA fragments, an ad hoc bioinformatic pipeline extracts the information for further downstream analysis.
[摘要] 该协议旨在获得CpGs中5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平的碱基分辨率信息，而无需亚硫酸氢盐修饰。 它依赖于（i）通过称为“选择性化学标记”（参见Szulwach等人，2012）的方法捕获羟甲基化序列和（ii）通过外切核酸酶消化捕获的DNA。 在消化的DNA片段的Illumina测序之后，特设的生物信息学管道提取信息用于进一步的下游分析。
【背景】基因组DNA中胞嘧啶的甲基化可以被蛋白质读取，并且主要被翻译成基因沉默。基因组中的大多数CpG二核苷酸是甲基化的，包括位于基因调控区如增强子的那些。然而，当需要时，这些CpG可以通过Ten Eleven Translocation（TET）酶将甲基氧化并且通过碱基切除修复系统用未甲基化的胞嘧啶置换来去甲基化。 5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是5-甲基胞嘧啶的第一个氧化衍生物，并且在基因组中绘制该修饰的碱基提供了关于正在进行活性去甲基化的区域的信息。尽管选择性化学标记（SCL）可以非常特异地检测5hmC，但该技术的分辨率受DNA片段大小的限制，特别是当捕获的DNA中存在多个CpG时。为了提高分辨率，我们引入了使用外切核酸酶的消化步骤，所述核酸外切酶将DNA分子修剪成靠近羟甲基化的胞嘧啶（Sérandour et。，2016）。然后对测序读数进行适当的生物信息学处理，然后将羟甲基化评分赋予捕获的CpG。
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| In vitro Assay to Measure DNA Polymerase β Nucleotide Insertion Coupled with the DNA Ligation Reaction during Base Excision Repair
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2017-06-20
[Abstract] We previously reported that oxidized nucleotide insertion by DNA polymerase β (pol β) can confound the DNA ligation step during base excision repair (BER) (Çağlayan et al., 2017). Here, we describe a method to investigate pol β nucleotide insertion coupled with DNA ligation, in the same reaction mixture including dGTP or 8-oxo-dGTP, pol β and DNA ligase I. This in vitro assay enables us to measure the products for correct vs. oxidized nucleotide insertion, DNA ligation, and ligation failure, i.e., abortive ligation products, as a function of reaction time. This ...
[摘要] 我们以前报告说，通过DNA聚合酶β（polβ）的氧化的核苷酸插入可能会在碱基切除修复（BER）（Çağlayan等，2017）期间混淆DNA连接步骤。 在这里，我们描述了在与dGTP或8-氧代-dGTP，polβ和DNA连接酶I相同的反应混合物中研究与DNA连接相结合的polβ核苷酸插入的方法。该体外测定使得我们能够测量产物的正确性 与氧化核苷酸插入，DNA连接和连接失败，即流产结扎产物，作为反应时间的函数。 该协议补充了我们以前的出版物，并描述了一种有效的方法来分析BER酶的活性和polβ和DNA连接酶I在体外的功能相互作用。
【背景】该方案是观察BER路径的最后两个步骤：通过连接酶I通过polβ进行核苷酸插入和DNA连接。使用该方案，在体外在同一反应混合物中测量两种反应作为时间的函数。原始实体是在模拟BER中间体的单核苷酸缺口DNA底物上分析BER酶polβ和DNA连接酶I。这些BER酶与此BER中间体结合并起作用。该方案中使用的DNA底物包括在5'和3'端的荧光标记，使我们能够观察DNA底物的单核苷酸插入和DNA连接。与DNA连接偶联的polβ核苷酸插入模拟了切口DNA中间体从核苷酸插入步骤切换或引导到BER途径期间的连接步骤。使用该方案，也可以在polβ氧化的核苷酸（8-氧代-dGTP）插入后测量连接失败或者终止连接。这通过在BER中间体的5'-末端添加腺苷酸（AMP）基团进行定量来实现。该方案也可用于测量与其他DNA聚合酶和DNA连接酶连接的核苷酸插入。 ...
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| Sequencing of Ebola Virus Genomes Using Nanopore Technology
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2016-11-05
[Abstract] Sequencing of virus genomes during disease outbreaks can provide valuable information for diagnostics, epidemiology, and evaluation of potential countermeasures. However, particularly in remote areas logistical and technical challenges can be significant. Nanopore sequencing provides an alternative to classical Sanger and next-generation sequencing methods, and was successfully used under outbreak conditions (Hoenen et al., 2016; Quick et al., 2016). Here we describe a protocol used for sequencing of Ebola virus under outbreak conditions using Nanopore technology, which we ...
[摘要] 病毒基因组在疾病爆发期间的测序可以为诊断，流行病学和潜在对策的评估提供有价值的信息。然而，特别是在偏远地区，后勤和技术挑战可能很大。纳米孔测序提供了经典的Sanger和下一代测序方法的替代物，并且在爆发条件下成功使用（Hoenen等人，2016; Quick等人，2016 ）。在这里我们描述了用于在爆发条件下使用纳米孔技术对埃博拉病毒进行测序的方案，我们在CDC/NIH诊断实验室（de Wit等人，2016）成功地实施了ELWA- 3 确定病毒基因组的全长序列是必不可少的，因为它是在利比里亚蒙罗维亚的埃博拉病毒治疗股在最近在西非爆发的埃博拉病毒爆发期间。
<病毒学中的程序。虽然经典的方法涉及sanger测序后引物步行战略，较新的方法涉及使用下一代测序方法，如454，illumina或ion torrent技术。所有这些技术的常见问题，尽管它们的许多优点，是所需的仪器是大的，昂贵的，脆弱的，因此难以运输。此外，经常涉及文库制备程序。虽然在通常情况下这些问题没有什么影响，因为这些机器在具有优良基础设施的专门实验室中运行，在偏远地区的病毒爆发期间（例如在埃博拉病毒爆发的情况下），这可能造成重大问题，特别是在样品出口从受影响的地区到这些专门的实验室往往在政治和后勤方面具有挑战性。在这些情况下，可以容易和快速地部署到偏远地区，并允许在爆发区域直接进行测序的测序技术的可用性是非常有价值的。因此，我们已经在monrovia的elwa-3埃博拉病毒治疗单元的现场诊断实验室测试了minion测序装置，该装置当时正在由oxford="" nanopore="" technologies（ont）开发。（de="" wit等人，/em="">。，2016），并且制定了在这些条件下快速产生埃博拉病毒的全长序列的方案。该装置使用纳米孔，核苷酸链通过其以受控的方式运输。核苷酸阻断并因此调节流过这些孔的离子流，这取决于通过纳米孔的核苷酸的物理性质，并且这些电流调节通过装置测量并翻译成核苷酸序列。该测试的结果表明该技术确实显示出作为可快速部署和高度可用的测序平台的巨大前景，其在其他地方是可用的（Hoenen等人，2016），以及类似的使用与Quick自己的努力独立地执行的相同测序平台进行的测试。 （2016年）。
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