| Deoxycholate Fractionation of Fibronectin (FN) and Biotinylation Assay to Measure Recycled FN Fibrils in Epithelial Cells
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Fibronectin (FN) is an extracellular matrix protein that is secreted by many cell types and binds predominantly to the cell surface receptor Integrin α5β1. Integrin α5β1 binding initiates the step-wise assembly of FN into fibrils, a process called fibrillogenesis. We and several others have demonstrated critical effects of fibrillogenesis on cell migration and metastasis. While immunostaining and microscopy methods help visualize FN incorporation into fibrils, with each fibril being at least 3 μm in length, the first study that developed a method to biochemically fractionate FN to quantify ...
[摘要] 纤连蛋白（FN）是一种细胞外基质蛋白，由许多细胞类型分泌，主要与细胞表面受体整合素α5β1结合。整合素α5β1结合启动FN逐步组装成原纤维，这一过程称为原纤维形成。我们和其他几个人已经证明了原纤维形成对细胞迁移和转移的关键作用。虽然免疫染色和显微镜方法有助于可视化FN掺入原纤维，每个原纤维的长度至少为3μm，但是第一项研究开发了一种生物化学分离FN以量化原纤维并入FN的方法，由Jean Schwarzbauer小组于1996年出版。我们的方案改编自原始出版物，并已在多种细胞类型上进行测试，包括如此处所示的MCF10A乳腺上皮细胞和Caki-1肾癌上皮细胞。使用两种洗涤剂提取物，将细胞FN分离成不溶于洗涤剂或掺入原纤维的FN和可溶性FN或未掺入的级分。为了确定原纤维形成是否利用FN的再循环池，我们使用了生物素标记的FN（FN-生物素）再循环测定，其已经从先前的研究中修改。使用再循环测定和脱氧胆酸盐分离方法的组合，可以定量地证明在不同实验条件下细胞中原纤维形成的程度，并确定原纤维形成的FN来源
【背景】 纤连蛋白（FN）是普遍产生的细胞外基质（ECM）组分（Uitto et al。，1989; Mao和Schwarzbauer，2005）。纤连蛋白库是转录产生的，可以通过几种生长因子如TGF-β1增加（Yokoi et al。，2002; Mimura ...
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| Rapid IFM Dissection for Visualizing Fluorescently Tagged Sarcomeric Proteins
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] Sarcomeres, the smallest contractile unit of muscles, are arguably the most impressive actomyosin structure. Yet a complete understanding of sarcomere formation and maintenance is missing. The Drosophila indirect flight muscle (IFM) has proven to be a very valuable model to study sarcomeres. Here, we present a protocol for the rapid dissection of IFM and analysis of sarcomeres using fluorescently tagged proteins.
[摘要] 肌肉最小的收缩单位肌肉，可以说是最令人印象深刻的肌动球蛋白结构。 然而，缺少对肌节形成和维护的完整理解。 果蝇间接飞行肌肉（IFM）已被证明是研究肌节的一个非常有价值的模型。 在这里，我们提出了快速解剖IFM和使用荧光标记的蛋白质分析肌节的协议。
【背景】能够使横纹肌纤维收缩的细胞骨架结构是数以百计的称为肌原纤维的电缆。肌原纤维又是一系列连续排列的肌节，全部同时收缩。肌节是完美对称的结构，包含收缩所需的所有元素。在肌节的中心位置是M-线，其中肌球蛋白粗丝被锚定。在肌小节的侧面是Z-盘，其中肌动蛋白细丝被锚定。
肌营养不良是导致进行性骨骼肌无力的遗传性疾病（Schröder和Schoser，2009）。对于肌营养不良症，目前尚无法治愈，可能是由于对肌营养不良症基础的分子机制的不完全理解（Olive et al。，2013）。黑腹果蝇是一种有效的遗传模式生物，由于其生命周期短，经济的维护和丰富的可利用资源而被用于研究肌肉生物学（Hales等人，2015; Wangler等，等人，2015年）。
在果蝇中的飞行由间接飞行肌肉（IFM）（苍蝇中最大的肌肉）的同步动作驱动，后者被进一步细分为背纵肌（DLM）和背腹肌（DVM）。 ...
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| Adoptive Transfer of Lung Antigen Presenting Cells
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2017-03-20
[Abstract] Our protocol describes adoptive transfer of antigen presenting cells (APCs) isolated from the lungs by enzymatic digestion and magnetic enrichment. This protocol can be used to study APC functions and trafficking.
[摘要] 我们的方案描述了通过酶消化和磁力富集从肺分离的抗原呈递细胞（APC）的过继转移。该协议可用于研究APC功能和贩运。
背景 包括巨噬细胞和树突状细胞（DC）在内的肺癌APC在感染侵袭性病原体，引发T细胞应答和控制耐受性反应中发挥关键作用。肺DC是稳定状态下最有效的专业APC，包括常规DC（cDC）和浆细胞样DC（pDC），以及炎症时新招募的单核细胞衍生的DC（moDC）（Kopf等人）。 ，2015）。肺静脉巨噬细胞，包括肺泡巨噬细胞，间质巨噬细胞和支气管巨噬细胞，在呈递抗原方面的效力较低。
＆nbsp;所有巨噬细胞和cDC在其细胞表面表达高水平的CD11c，而pDC表达中等水平的CD11c（Becher等，2014）。因此，CD11c磁性微珠可用于分离小鼠肺巨噬细胞和cDC。我们开发了一种从正常小鼠中分离肺APCs的方案，然后将其过渡转移到同基因骨髓移植小鼠。我们使用该方案来确定正常的肺APCs是否足以恢复移植后疱疹病毒感染的T辅助细胞极化（Zhou等人，2016）。
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