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Date:
2017-03-20
[Abstract] Quantitative measurement of proteins binding to DNA is a requisite to fully characterize the structural determinants of complex formation necessary to understand the DNA transactions that regulate cellular processes. Here we describe a detailed protocol to measure binding affinity of the adeno-associated virus (AAV) Rep68 protein for the integration site AAVS1 using fluorescent anisotropy. This protocol can be used to measure the binding constants of any DNA binding protein provided the substrate DNA is fluorescently labeled.
[摘要] 与DNA结合的蛋白质的定量测量是完全表征理解调节细胞过程的DNA交易所必需的复合物形成结构决定簇的必要条件。在这里，我们描述了使用荧光各向异性来测量腺相关病毒（AAV）Rep68蛋白与整合位点AAVS1的结合亲和力的详细方案。如果底物DNA被荧光标记，则该方案可用于测量任何DNA结合蛋白的结合常数。
背景 荧光偏振各向异性已经成为测量蛋白质与大分子，核酸，肽和其他蛋白质等多种配体相互作用的最流行方法之一。该方法快速，便宜，可以修改为配备荧光检测器的读卡器。该技术基于以下原理：当荧光分子被平面偏振光激发时，如果分子是静止的或者如果其旋转缓慢，发射的光在同一平面内保持极化。相反，如果分子快速旋转（由于体积小），则光在不同的平面中发射。这些变化可以通过平行和垂直强度的归一化差异量化。极化被定义为P =（I⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥）其中I = 是平行强度，I⊥是垂直强度。一种替代方式是定义各向异性，A =（I⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥⊥< ub="">）。两个参数可以互换使用来描述极化的变化。因此，当小荧光DNA分子结合蛋白质时，较大的复合物将比DNA分子旋转得更慢，改变偏振光的平面并提高各向异性值。我们已经使用这种技术来测量AAV ...
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