Characterization of Protein Domain Function via in vitro DNA Shuffling
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] We recently investigated the molecular events that drive evolution of the CTX-M-type β-lactamases by DNA shuffling of fragments of the blaCTX-M-14 and blaCTX-M-15 genes. Analysis of a total of 51 hybrid enzymes showed that enzymatic activity could be maintained in most cases, yet the enzymatically active hybrids were found to possess much fewer amino acid substitutions than the few hybrids that became inactive, suggesting that point mutations in the constructs rather than reshuffling of the fragments of the two target genes would more likely cause ...
[摘要] 我们最近研究了通过对CTX-M-14和EMX-M-14的片段进行DNA改组来驱动CTX-M型β-内酰胺酶进化的分子事件, bla CTX-M-15基因。 总共51种杂合酶的分析显示酶活性在大多数情况下可以保持,但是酶活性杂合体被发现比少数杂交体具有少得多的氨基酸取代,这表明构建体中的点突变而不是 两个靶基因片段的重新洗牌将更可能导致CTX-M活性的破坏。 确定了一些在介导酶活性中起重要作用的重要残基。 这些发现表明,DNA改组是一种有效的方法来鉴定和表征细菌蛋白质中的重要功能结构域。
【背景】DNA重组是一种自然过程,通过该过程,细菌之间交换遗传物质以增强环境压力下的生存适应性。几种杂交CTX-M-内酰胺酶(CTX-M-64,CTX-M-123,CTX-M-137和CTX-M-132)可能是由bla CTX-M-14和 bla CTX-M-15基因是世界上最常见的变异体,近年来已有报道(Nagano et al。 ,2009; Tian et al。,2014; He et al。,2015; Liu et。, 2015年)。在这些杂合酶中,包含CTX-M-15的N-和C-末端部分和CTX-M-14的中间片段的CTX-M-64显示出比其亲本原型更高的催化活性(He <等)。,2015)。
DNA改组是一种分子途径,被设计为通过PCR介导的两种靶基因的随机组合来模拟和加速进化过程(Crameri ...
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Infectious Subviral Particle to Membrane Penetration Active Particle (ISVP-to-ISVP*) Conversion Assay for Mammalian Orthoreovirus
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] The mammalian orthoreovirus (reovirus) outer capsid undergoes a series of conformational changes prior to or during viral entry. These transitions are necessary for delivering the genome-containing core across host cell membranes. This protocol describes an in vitro assay for monitoring the transition into a membrane penetration-active form (i.e., ISVP*).
[摘要] 哺乳动物正面病毒(呼肠孤病毒)外壳在病毒进入之前或过程中经历一系列构象变化。 这些转换对于跨宿主细胞膜递送含基因组的核心是必要的。 该协议描述了用于监测向膜渗透活性形式(即,ISVP *)的转变的体外试验。
【背景】呼肠孤病毒是无包膜的双链RNA病毒,其由两个同心蛋白质壳组成:内衣壳(核心)和外衣壳(Dryden等人,1993; Zhang等人, / ,2005; Dermody et al ,2013)。在附着之后,病毒颗粒被内吞(Borsa et al。,1979; Ehrlich et al。,2004; Maginnis et al。,2006; Maginnis和宿主组织蛋白酶蛋白酶降解σ3外壳蛋白(Chang和Zweerink,1971; Silverstein等人,1972; Borsa等人,et al。 1981; Sturzenbecker等人,1987; Dermody等人,1993; Baer和Dermody,1997; Ebert等人, 2002年)。这个过程产生一个亚稳中间体,称为感染性亚病毒颗粒(ISVP),其中细胞穿透蛋白μ1被暴露(Dryden等人,1993)。 ISVPs是通过用糜蛋白酶处理纯化的病毒体而在体外产生的(Joklik,1972; ...
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Infectious Subviral Particle-induced Hemolysis Assay for Mammalian Orthoreovirus
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Mammalian orthoreovirus (reovirus) utilizes pore forming peptides to penetrate host cell membranes. This step is essential for delivering its genome containing core particle during viral entry. This protocol describes an in vitro assay for measuring reovirus-induced pore formation.
[摘要] 哺乳动物正面病毒(呼肠孤病毒)外壳在病毒进入之前或过程中经历一系列构象变化。 这些转换对于跨宿主细胞膜递送含基因组的核心是必要的。 该协议描述了用于监测向膜渗透活性形式(即,ISVP *)的转变的体外试验。
【背景】呼肠孤病毒是无包膜的双链RNA病毒,其由两个同心蛋白质壳组成:内衣壳(核心)和外衣壳(Dryden等人,1993; Zhang等人, / ,2005; Dermody et al ,2013)。在附着之后,病毒颗粒被内吞(Borsa et al。,1979; Ehrlich et al。,2004; Maginnis et al。,2006; Maginnis和宿主组织蛋白酶蛋白酶降解σ3外壳蛋白(Chang和Zweerink,1971; Silverstein等人,1972; Borsa等人,et al。 1981; Sturzenbecker等人,1987; Dermody等人,1993; Baer和Dermody,1997; Ebert等人, 2002年)。这个过程产生一个亚稳中间体,称为感染性亚病毒颗粒(ISVP),其中细胞穿透蛋白μ1被暴露(Dryden等人,1993)。 ISVPs是通过用糜蛋白酶处理纯化的病毒体而在体外产生的(Joklik,1972; ...
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