| A Method for SUMO Modification of Proteins in vitro
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] The Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO) is a protein that is post-translationally added to and reversibly removed from other proteins in eukaryotic cells. SUMO and enzymes of the SUMO pathway are well conserved from yeast to humans and SUMO modification regulates a variety of essential cellular processes including transcription, chromatin remodeling, DNA damage repair, and cell cycle progression. One of the challenges in studying SUMO modification in vivo is the relatively low steady-state level of a SUMO-modified protein due in part to the activity of SUMO deconjugating enzymes ...
[摘要] 小泛素相关修饰物（SUMO）是一种蛋白质，其翻译后添加到真核细胞中并可逆地从其他蛋白质中去除。 SUMO和SUMO途径的酶从酵母到人类都很保守，SUMO修饰调节了多种基本细胞过程，包括转录，染色质重塑，DNA损伤修复和细胞周期进程。 研究SUMO修饰体内的挑战之一是SUMO修饰蛋白的相对低的稳态水平，部分原因是SUMO去缀合酶（SUMO Isopeptidases或SENPs）的活性。 幸运的是，使用重组SUMO酶可以在体外研究SUMO修饰。 在这里，我们描述了一种灵敏的方法，用于检测目标人类蛋白质的SUMO修饰，使用来自兔网织红细胞和放射性标记的氨基酸的体外转录和翻译系统。
【背景】与其他泛素蛋白家族修饰一样，SUMO修饰通过ATP依赖性酶促级联发生，涉及E1激活酶（人类中的Aos1 / Uba2异二聚体），E2结合酶（Ubc9）和许多E3连接之一的连续活性。酶（Gareau和Lima，2010）。具有SUMO缀合共有位点的蛋白质ΨKxE（Ψ是疏水残基，其后是赖氨酸，任何氨基酸和谷氨酸），可以通过哺乳动物中表达的一种或几种SUMO旁系同源物（包括SUMO1，SUMO2）进行有效修饰。或SUMO3（统称为SUMO2 / 3，因为它们的序列同源性为97％）（Gareau和Lima，2010; Flotho和Melchior，2013）。 ...
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| In vitro Analysis of Ubiquitin-like Protein Modification in Archaea
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] The ubiquitin-like (Ubl) protein is widely distributed in Archaea and involved in many cellular pathways. A well-established method to reconstitute archaeal Ubl protein conjugation in vitro is important to better understand the process of archaeal Ubl protein modification. This protocol describes the in vitro reconstitution of Ubl protein modification and following analysis of this modification in Haloferax volcanii, a halophilic archaeon serving as the model organism.
[摘要] 泛素样（Ubl）蛋白广泛分布于古细菌中并参与许多细胞途径。 为了更好地理解古细菌Ub1蛋白质修饰的过程，重建体外古细菌Ubl蛋白质缀合物的完善方法是很重要的。 该协议描述了Ubl蛋白质修饰的体外重建以及在作为模型生物的嗜盐古细菌Haloferax volcanii 中对这种修饰进行分析。
【背景】泛素（Ub）与靶蛋白共价连接的过程被称为泛素化，其控制真核细胞中大量的细胞过程（Glickman和Ciechanover，2002; Komander和Rape，2012）。遍在蛋白化由一系列酶（包括Ub激活酶（E1），Ub结合酶（E2s）和Ub连接酶（E3s））催化。泛素化的体外重建是确定酶之间或E3与蛋白质底物之间特异性的有用测定法（Zhao等人，2012）。在古细菌中，Ubl蛋白SAMP采用Ub折叠，并且与E1样酶UbaA催化的蛋白靶标异肽连接[Maupin-Furlow，（2014）综述]。尽管E1同系物在古细菌中广泛存在，但基于一级序列比较，在大多数古细菌中未预测经典E2或E3酶。我们最近对Haloferax volcanii的研究表明甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）是Ubl蛋白质修饰（sampylation）与UbaA一起在体内温和的氧化条件下和< （体外）（fu="">
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| Chase Assay of Protein Stability in Haloferax volcanii
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Highly regulated and targeted protein degradation plays a fundamental role in almost all cellular processes. Determination of the protein half-life by the chase assay serves as a powerful and popular strategy to compare the protein stability and study proteolysis pathways in cells. Here, we describe a chase assay in Haloferax volcanii, a halophilic archaeon as the model organism.
[摘要] 高度调节和靶向的蛋白质降解在几乎所有的细胞过程中发挥重要作用。通过追踪测定法测定蛋白质半衰期是比较蛋白质稳定性和研究细胞中蛋白水解途径的有力和普遍的策略。在这里，我们描述了作为模型生物体的嗜盐古细菌Haloferax volcanii 中的追踪测定。
背景 在真核生物中，泛素蛋白酶体系统在高选择性和靶向性蛋白水解中起主要作用（Glickman and Ciechanover，2002）。最近的证据表明，小型古细菌泛素样修饰蛋白或SAMPs也起到了蛋白酶体破坏的靶向蛋白的作用（Maupin-Furlow，2014; Anjum等人，2015; Fu et al。 。，2016）。体内蛋白质半衰期的测量提供了研究蛋白水解途径的直接途径。环己酰胺追踪和脉冲追踪测定通常用于监测真核生物中靶向蛋白质的降解（Zhou，2004）。前一种方法用于确定放线菌酮抑制平移伸长后所有细胞蛋白的半衰期;而脉冲追踪测定法测量新合成（脉冲标记）蛋白质的周转率，而不干扰正常的细胞生长。与真核系统相比，确定古细菌中一种给定蛋白质半衰期的快速简便方法尚未明确。因此，我们开发了一种方案，用于测量盐爱好的考古Haloferax volcanii的体内蛋白质稳定性。使用翻译抑制剂（茴香霉素）和转录（放线菌素D）来最小化该古细菌中新蛋白质的合成。 ...
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