| Separation and Purification of Glycosaminoglycans (GAGs) from Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The nematode Caenorhabditis elegans is a popular model organism for studies of developmental biology, neurology, ageing and other fields of basic research. Because many developmental processes are regulated by glycosaminoglyans (GAGs) on cell surfaces and in the extracellular matrix, methods to isolate and analyze C. elegans GAGs are needed. Such methods have previously been optimized for other species such as mice and zebrafish. After modifying existing purification protocols, we could recently show that the nematodes also produce chondroitin sulfate, in addition to heparan ...
[摘要] 线虫秀丽隐杆线虫是研究发育生物学，神经学，衰老等基础研究领域的流行模型生物。 因为许多发育过程由细胞表面和细胞外基质中的糖胺聚糖（GAG）调节，分离和分析C的方法。 线虫需要GAG。 此类方法先前已针对其他物种如小鼠和斑马鱼进行了优化。 在修改现有的纯化方案后，我们最近可以显示除了硫酸乙酰肝素外，线虫也产生硫酸软骨素，因此挑战了仅通过C合成非硫酸软骨素的观点。线虫。 我们在这里介绍我们适用于C的协议。线虫。 由于净化策略涉及非硫酸化和硫酸化GAG的分离，所以对于其他可能有利的方法也是有用的。
【背景】糖胺聚糖（GAG）是重复二糖单元的直链多糖链，其通常被硫酸根取代。除了透明质酸，其是在质膜上合成而不被锚定到任何蛋白质的非硫酸化GAG，所有其他GAG都与核心蛋白共价连接，从而形成蛋白聚糖（PG）。在PG上发现的最常见的GAG是硫酸乙酰肝素（HS）和硫酸软骨素（CS）/硫酸皮肤素，含有N-乙酰基 - 葡糖胺和N，N-乙酰基 - 半乳糖胺，分别（张，2010）。在高尔基隔室的生物合成过程中，它们是非模板驱动的过程，它们经过多种修饰，包括将葡萄糖醛酸差向异构化成艾杜糖醛酸，并在不同位置硫酸化（Bulow和Hobert，2006; ...
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| Mapping RNA Sequences that Contact Viral Capsid Proteins in Virions
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] We have adapted the methodology of CLIP-seq (Crosslinking-Immunoprecipitation and DNA Sequencing) to map the segments of encapsidated RNAs that contact the protein shells of virions. Results from the protocol report on the RNA sequences that contact the viral capsid.
[摘要] 我们已经调整了CLIP-seq（交联 - 免疫沉淀和DNA测序）的方法来绘制与病毒粒子的蛋白质壳接触的壳化RNA片段。 关于接触病毒衣壳的RNA序列的方案报告的结果。
【背景】正义RNA病毒包括所有生命形式的病原体。具有二十面体形状的病毒具有病毒外壳蛋白在RNA基因组周围形成保护壳（Stockley等人，2013）。在噬菌体MS2和植物感染的Brome花叶病毒（BMV）中，外壳蛋白优先接触特异性RNA序列（Ni等人，2013; Hoover等人。 ，2016; Rolfsson等人，2016）。这些接触可以调节感染期间RNA释放的时间，病毒基因表达和病毒RNA复制（Hoover等人，2016）。鉴定衣壳RNA相互作用可以提供对病毒感染的规定的见解，并提供抑制病毒感染的手段。考虑到这一点，我们已经开发了一种方法，使用UV交联，RNA断裂，外壳蛋白的选择性沉淀和由RNA片段制备的cDNA的下一代测序来鉴定纯化的病毒体中的衣壳RNA接触。以下协议是针对BMV病毒粒子开发的。
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| Heparan Sulfate Identification and Characterisation: Method II. Enzymatic Depolymerisation and SAX-HPLC Analysis to Determine Disaccharide Composition
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Heparan sulfate (HS) is purified from complex matrices and often not fully characterised to validate its assignment. The characterisation of heparins and heparan sulfates through enzymatic depolymerisation and subsequent strong anion-exchange high performance liquid chromatography (SAX-HPLC) analysis and quantitation of the resulting disaccharides is a critical tool for assessing the structural composition of this class of compound. This protocol details a methodology to reproducibly determine the disaccharide composition of heparan sulfate by enzymatic depolymerisation and SAX-HPLC analysis. ...
[摘要] 从复杂基质中纯化硫酸肝素（HS），并且通常没有完全表征以验证其分配。 通过酶促解聚和随后的强阴离子交换高效液相色谱（SAX-HPLC）分析和定量所得二糖来描述肝素和硫酸乙酰肝素是评估该类化合物的结构组成的关键工具。 该方案详述了通过酶促解聚和SAX-HPLC分析可重复地确定硫酸乙酰肝素的二糖组成的方法。 Carnachan和Hinkley（2017）可以找到一种用于硫酸乙酰肝素鉴定和表征的补充方法。
肝素和HS的结构分析存在一些方法。 该方案旨在为肝素和HS的酶解解提供优化的方法，并分析和定量其中产生的二糖。 非常少的公开分析考虑了总组合物的所有方面，包括解聚程度与获得的二糖组合的结合（Skidmore等人，2006和2010; Carnachan等人。，2016）。 当样品随后用于总是剂量依赖性的生物测定中时，这尤其令人担忧。 本文描述的酶程序是研究调查最佳酶活性和HS解聚所需条件的详细研究的最终结果（Carnachan等人，2016）。 该程序旨在提供适用于没有经验的糖胺聚糖（GAG）分析的实验室的逐步方案。
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