| In vivo Analysis of Cyclic di-GMP Cyclase and Phosphodiesterase Activity in Escherichia coli Using a Vc2 Riboswitch-based Assay
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Cyclic di-guanosine monophosphate (c-di-GMP) is a ubiquitous second messenger that regulates distinct aspects of bacterial physiology. It is synthesized by diguanylate cyclases (DGCs) and hydrolyzed by phosphodiesterases (PDEs). To date, the activities of DGC and PDE are commonly assessed by phenotypic assays, mass spectrometry analysis of intracellular c-di-GMP concentration, or riboswitch-based fluorescent biosensors. However, some of these methods require cutting-edge equipment, which might not be available in every laboratory. Here, we report a new simple, convenient and cost-effective ...
[摘要] 环状二磷酸鸟苷（c-di-GMP）是一种无处不在的第二信使，它调节细菌生理学的不同方面。 它由diguanylate环化酶（DGC）合成并被磷酸二酯酶（PDE）水解。 迄今为止，通常通过表型分析，细胞内c-di-GMP浓度的质谱分析或基于核糖开关的荧光生物传感器来评估DGC和PDE的活性。 但是，其中一些方法需要尖端设备，而这些设备可能不适用于每个实验室。 在这里，我们报告了一个新的简单，方便和具有成本效益的系统，用于评估E中DGC和PDE的功能。大肠杆菌。 该系统利用核糖开关对c-di-GMP的高特异性及其响应于c-di-GMP浓度而调节下游β-半乳糖苷酶报道基因的表达的能力。 在该协议中，我们描述了该系统的构建及其用于评估DGC和PDE酶的活性。
【背景】Cyclic-di-GMP是细菌中重要且无处不在的第二信使，其调节各种过程，例如运动到衰退转变，生物膜形成，毒力和细胞周期进展（Römling等人， ，2013）。 GG（D / ...
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| Design and Direct Assembly of Synthesized Uracil-containing Non-clonal DNA Fragments into Vectors by USERTM Cloning
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] This protocol describes how to order and directly assemble uracil-containing non-clonal DNA fragments by uracil excision based cloning (USER cloning). The protocol was generated with the goal of making synthesized non-clonal DNA fragments directly compatible with USERTM cloning. The protocol is highly efficient and would be compatible with uracil-containing non-clonal DNA fragments obtained from any synthesizing company. The protocol drastically reduces time and handling between receiving the synthesized DNA fragments and transforming with vector and DNA fragment(s).
[摘要] 该协议描述如何通过基于尿嘧啶切除的克隆（USER克隆）命令并直接组装尿嘧啶非克隆DNA片段。 该方案的目的是制备与USER TM克隆直接兼容的合成非克隆DNA片段。 该协议是高效率，并将与从任何合成公司获得尿嘧啶非克隆DNA片段相容。 该方案大大减少了接收合成的DNA片段和用载体和DNA片段转化之间的时间和处理。
【背景】对于合成的DNA，非克隆线性DNA片段（NCDF）已经成为更廉价和更快速的替代克隆片段的方法，并且在循环载体中被测序。 NCDF可以被认为是IKEA DNA合成的解决方案，在这个解决方案中，客户将他们的DNA片段组装成一个选择的载体，随后必须验证最终构建体的序列。在这个协议中，我们从Thermo Fisher Scientific ...
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| Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Barley Seedling Leaves
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Author:
Date:
2015-06-20
[Abstract] Virus induced gene silencing (VIGS) is one of the most potent reverse genetics technologies for gene functional characterisation. This method exploits a dsRNA-mediated antiviral defence mechanism in plants. Using this method allows researchers to generate rapid phenotypic data in a relatively rapid time frame as compared to the generation of stable transformants. Here we describe a simple method for silencing a target gene in barley seedling leaves using vectors based on the Barley Stripe Mosaic Virus (BSMV).
[摘要] 病毒诱导的基因沉默（VIGS）是基因功能表征的最有效的反向遗传学技术之一。 这种方法利用dsRNA介导的抗病毒防御机制在植物中。 与稳定转化体的产生相比，使用该方法允许研究人员在相对快的时间框架中产生快速表型数据。 在这里我们介绍了一种简单的方法，使用基于大麦条纹花叶病毒（BSMV）的载体，在大麦幼苗叶片中沉默目标基因。
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