| Drosophila Model of Leishmania amazonensis Infection
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] This protocol describes how to generate and harvest antibody-free L. amazonensis amastigotes, and how to infect adult Drosophila melanogaster with these parasites. This model recapitulates key aspects of the interactions between Leishmania amastigotes and animal phagocytes.
[摘要] 该协议描述了如何产生和收获无抗体的L型。 amazonensis amastigotes，以及如何用这些寄生虫感染成年果蝇（Drosophila melanogaster）。 这个模型概括了利什曼原虫和动物吞噬细胞之间相互作用的关键方面。
【背景】由利什曼原虫引起的利什曼病，根据宿主的寄生虫种类和免疫状态，影响皮肤，粘膜或内脏器官。 尽管小鼠感染模型已经提供了我们对这种寄生虫感染的大部分了解，但它并不适合于大规模的探索性方法。 在我们的实验室，我们利用果蝇黑腹果蝇的易处理和强大的遗传学来建立利什曼原虫感染的模型并进行小规模的筛选来鉴定涉及的宿主基因 在这些寄生虫的吞噬中（Okuda等人，2016）。 具体而言，使用UAS-GAL4表达系统（Brand和Perrimon，1993），可能与吞噬作用相关的一组基因被特异性敲低，监测突变体感染的苍蝇的存活和寄生物负荷以鉴定 调节感染的因素。
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| Endogenous C-terminal Tagging by CRISPR/Cas9 in Trypanosoma cruzi
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] To achieve the C-terminal tagging of endogenous proteins in T. cruzi we use the Cas9/pTREX-n vector (Lander et al., 2015) to insert a specific tag sequence (3xHA or 3xc-Myc) at the 3’ end of a specific gene of interest (GOI). Chimeric sgRNA targeting the 3’ end of the GOI is PCR-amplified and cloned into Cas9/pTREX-n vector. Then a DNA donor molecule to induce DNA repair by homologous recombination is amplified. This donor sequence contains the tag sequence and a marker for antibiotic resistance, plus 100 bp homology arms corresponding to regions located right upstream of ...
[摘要] 为了实现克氏锥虫内源蛋白的C末端标记，我们使用Cas9 / pTREX-n载体（Lander等，2015）在3'末端插入特异性标签序列（3xHA或3xc-Myc）特定的感兴趣基因（GOI）。将靶向GOI 3'末端的嵌合sgRNA进行PCR扩增，并克隆到Cas9 / pTREX-n载体中。然后扩增通过同源重组诱导DNA修复的DNA供体分子。该供体序列包含标签序列和抗生素抗性标记，加上对应于位于终止密码子右上游的区域和在GOI基因座的Cas9靶位点下游的100bp同源臂。载体pMOTag23M（Oberholzer等，2006）或pMOHX1Tag4H（Lander等，2016b）用作DNA供体扩增的PCR模板。用sgRNA / Cas9 / pTREX-n构建体和DNA供体盒共转染的Epimastigotes然后用抗生素培养5周以选择双重抗性寄生虫。最终通过PCR和Western印迹分析验证了内源基因标记。
【背景】自从CRISPR / ...
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| Generation and Screening of a Non-typeable Haemophilus influenzae Tn-seq Mutant Library
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Author:
Date:
2014-03-05
[Abstract] The genome-wide screen Tn-seq (van Opijnen et al., 2009) is very valuable tools to identify bacterial genes with a conditionally essential function, for instance genes involved in bacterial virulence. These techniques are based on the generation of a random mutant library, which is grown in a control of challenge situation (Figure 1). The advantage of using a mariner transposon for the generation of a random transposon mutant library is its insertion into TA sites, which makes the insertion in the genome highly random. In addition, an MmeI restriction site can be introduced in the ...
[摘要] 全基因组筛选Tn-seq（van Opijnen等人，2009）是鉴定具有条件必需功能的细菌基因（例如涉及细菌毒力的基因）的非常有价值的工具。 这些技术基于产生随机突变体文库，其在挑战情况的对照中生长（图1）。 使用水手转座子产生随机转座子突变体文库的优点是其插入TA位点，这使得在基因组中的插入高度随机。 此外，可以在转座子的反向重复中引入MmeI限制位点，而不影响HimarC9转座酶的识别。
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