Time-lapse Observation of Chromosomes, Cytoskeletons and Cell Organelles during Male Meiotic Divisions in Drosophila
|
Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] In this protocol, we provide an experimental procedure that perform time-lapse observation of intra-cellular structures such as chromosomes, cytoskeletons and cell organelles during meiotic cell divisions in Drosophila males. As primary spermatocyte is the largest dividing diploid cell in Drosophila, which is equivalent in size to mammalian cultured cells, one can observe dynamics of cellular components during division of the model cells more precisely. Using this protocol, we have showed that a microtubule-associated protein plays an essential role in microtubule dynamics ...
[摘要] 在这个协议中,我们提供了一个实验程序,在果蝇男性的减数分裂细胞分裂期间,进行细胞内结构如染色体,细胞骨架和细胞器的延时观察。由于主要精母细胞是果蝇中最大的分裂二倍体细胞,其大小与哺乳动物培养细胞相当,可以更准确地观察模型细胞分裂期间细胞组分的动力学。使用该方案,我们已经表明,微管相关蛋白在微管动力学中起重要作用,并通过微管和肌动球蛋白丝之间的相互作用开始裂解沟槽。我们还报道说,需要核膜组分来形成和/或维持在果蝇细胞中细胞分裂所必需的主轴包络。
在果蝇中,也可以在标准培养条件下良好培养的良好培养细胞系。然而,它们的单元尺寸,特别是细胞质体积,比哺乳动物细胞的小得多。这在细胞分裂过程中损害了细胞成分的检查。精母细胞,在另一方面,实现第一次减数分裂开始之前不同的细胞生长。主要精母细胞是出现在果蝇发育中的增殖细胞中最大的二倍体细胞。因此,可以使用光学显微镜容易地细分观察分裂细胞中的细胞结构。在果蝇黑腹果蝇中,提供了先进和复杂的遗传技术(Ashburner等人,2004)。染色体分离和细胞分裂中的减数分裂缺陷出现在完成2< 减数分裂后精子细胞的细胞组织中。通过观察这种早期精子细胞,人们可以很容易地发现甚至微小的减数分裂异常(2012); 2012年; ...
|
|
Secretion of Adipsin as an Assay to Measure Flux from the Endoplasmic Reticulum (ER)
|
Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] In this protocol we describe a quantitative biochemical assay to assess the efficiency of endoplasmic reticulum (ER) to Golgi protein transport in adipocytes (Bruno et al., 2016). The assay takes advantage of the fact that adipocytes secrete various bioactive proteins, known as adipokines. As a measure of ER to Golgi flux we determine the rate of bulk secretion of the adipokine adipsin post washout of Brefeldin A (BFA) treatment using immunoblotting. Because BFA treatment results in an accumulation of adipsin in the ER, the exit of adipsin from the ER upon BFA washout is synchronized ...
[摘要] 在该方案中,我们描述了一种定量生化测定法来评估内质网(ER)对脂肪细胞中高尔基体蛋白质转运的效率(Bruno等,2016)。 该测定法利用脂肪细胞分泌各种生物活性蛋白质(称为脂肪因子)的事实。 作为对高尔基体通量的ER的测量,我们使用免疫印迹法确定了使用Brefeldin A(BFA)处理的脂肪因子adipsin后消失的体积分泌速率。 因为BFA治疗导致ER中Adipsin的积累,所以在BFA洗脱时,Adipsin从ER的出口在细胞和实验条件下同步。 因此,使用这种简单的测定法可以稳健地确定扰动,如敲低蛋白质,是否对高尔基蛋白转运的ER有影响。 【背景】新合成的蛋白质通过分泌途径从细胞分泌到细胞膜(PM)中。分泌路线包括从ER到高尔基体的运输,穿过高尔基体堆叠,以及从高尔基网络(TGN)到PM的运动。这些运输步骤中的每一个提供用于调节分泌物的节点。虽然大多数细胞能够分泌蛋白质,但某些特定的细胞类型是特异性蛋白质的专业秘密。脂肪细胞,例如,分泌激素,称为脂肪因子,影响各种器官的能量代谢。为了更好地了解脂肪因子分泌的分子基础,我们开发了一种测定方法,研究了从ER到脂肪细胞的高尔基体的脂肪因子,一种脂肪因子的转运。研究ER到高尔基体运输的传统和常用的方法是监测从ER融合到GFP(VSVG-GFP)的温度敏感性水泡性口炎病毒G蛋白ts045的出口(Presley等,1997)。使用adipsin分泌测定法研究脂肪细胞中的高铁运输的优点是监测来自ER的内源性蛋白质的通量,而不是异位表达的报道蛋白。 ...
|
|