| Generation and Implementation of Reporter BHK-21 Cells for Live Imaging of Flavivirus Infection
|
|
Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] The genus Flavivirus within the family Flaviviridae includes many viral species of medical importance, such as yellow fever virus (YFV), Zika virus (ZIKV), and dengue virus (DENV), among others. Presently, the identification of flavivirus-infected cells is based on either the immunolabeling of viral proteins, the application of recombinant reporter replicons and viral genomes, or the use of cell-based molecular reporters of the flaviviral protease NS2B-NS3 activity. Among the latter, our flavivirus-activatable GFP and mNeptune reporters contain a quenching peptide (QP) joined to the ...
[摘要] [摘要]本属黄病毒家族中的黄病毒包括医学重要性许多病毒种类，如黄热病病毒（YFV），寨卡病毒（ZIKV）和登革热病毒（DENV），等等。目前，黄病毒感染细胞的鉴定是基于病毒蛋白的免疫标记，重组报告子复制子和病毒基因组的应用，或黄病毒蛋白酶NS2B-NS3活性的基于细胞的分子报告子的使用。在后者中，我们的黄病毒可激活的GFP和mNeptune报道分子含有通过接头连接到荧光蛋白的淬灭肽（QP），该接头由黄病毒NS2B - NS3蛋白酶（AAQRRGRIG）的切割位点组成。当病毒蛋白酶切割接头时，淬灭肽被去除，并且荧光蛋白采用促进荧光的构象。在这里，我们提供了用于表达，选择和实施表达黄病毒基因编码分子报告子的稳定BHK-21细胞的详细协议，适用于通过活细胞成像监测病毒感染。我们还将描述图像分析过程并提供所需的软件管道。我们的报告细胞允许通过活细胞成像对黄病毒的参考菌株和天然菌株实施单细胞感染动力学以及噬菌斑测定。
图形摘要：
黄病毒感染实时成像的报告基因BHK-21细胞的产生与实施工作流。
[背景]黄病毒代表了正在引起并正在重新出现的全球性威胁，可能引起动物和人类疾病，包括许多与医学有关的病毒，例如黄热病病毒（YFV），西尼罗河病毒（WNV），日本脑炎病毒（JEV），登革热病毒（DENV），并兹卡六RUS（ZIKV），等等（摹·乌尔德·所罗门，2008） ...
|
|
|
| A Transient Transfection-based Cell Adhesion Assay with 293T Cells
|
|
Author:
Date:
2021-01-05
[Abstract] The in vitro cell adhesion assay is a quantitative method for measuring selective cell adhesion to specific proteins. Traditionally, cell adhesion assays employ purified protein immobilized on a solid glass or plastic surface. Here, we describe a transient 293T cell transfection-based cell adhesion assay to study selective cell adhesion of a specific cell type to a protein of interest. In this protocol, 293T cells are transfected with a mammalian expression plasmid containing mSiglec1 cDNA or an empty plasmid as a mock control and are then cultured to form a monolayer. Subsequently, these ...
[摘要] [摘要]的体外细胞粘附分析是一种用于测量到特定蛋白选择性细胞粘附的定量方法。传统上，细胞粘附测定采用固定在固体玻璃或塑料表面上的纯化蛋白质。在这里，我们描述了基于瞬时293T细胞转染的细胞粘附试验，以研究特定细胞类型对目标蛋白质的选择性细胞粘附。在该协议中，将293T细胞用包含mSiglec1 cDNA的哺乳动物表达质粒或空质粒作为模拟对照转染，然后培养以形成单层。随后，将这些表达Siglec1和模拟转染的293T细胞单层用于表达GFP的B16F10细胞的细胞粘附测定。GFP +的数量 粘附在每个293T单层上的癌细胞是一种定量手段，用于比较癌细胞与Siglec1的选择性粘附性。该方法消除了表达和纯化目的蛋白以进行体外细胞粘附测定的需要，并且可以容易地用难以纯化的蛋白进行操作，同时保持其天然的原位结构。
关键词：细胞粘附试验，细胞粘附，癌细胞粘附试验，293T，瞬时转染，Siglec1，F荧光显微镜
[背景]细胞-细胞相互作用对于生物学过程，例如组织发育，再生，和临界形态发生，以及免疫应答和癌症转移（Gumbiner，1996 ...
|
|
|
| A CRISPR Competition Assay to Identify Cancer Genetic Dependencies
|
|
Author:
Date:
2020-07-20
[Abstract] The CRISPR/Cas9 system is a powerful tool for genome editing, wherein the RNA-guided nuclease Cas9 can be directed to introduce double-stranded breaks (DSBs) at a targeted locus. In mammalian cells, these DSBs are typically repaired through error-prone processes, resulting in insertions or deletions (indels) at the targeted locus. Researchers can use these Cas9-mediated lesions to probe the consequences of loss-of-function perturbations in genes of interest. Here, we describe an optimized protocol to identify specific genes required for cancer cell fitness through a CRISPR-mediated cellular ...
[摘要] [摘要] CRISPR / Cas9系统是用于基因组编辑的强大工具，其中RNA引导的核酸酶Cas9可以直接在目标基因座处引入双链断裂（DSB）。在哺乳动物细胞中，这些DSB通常通过容易出错的过程进行修复，从而导致在目标基因座处插入或缺失（indel）。研究人员可以使用这些Cas9介导的病变来探究结果目标基因的功能丧失扰动。在这里，我们描述了一种优化的协议，可通过CRISPR介导的细胞竞争测定法来鉴定癌细胞适应性所需的特定基因。鉴定这些遗传依赖性至关重要，因为它们为抗癌药物的开发提供了潜在的靶标。该协议为研究人员提供了一种强大且可扩展的方法，以研究多种细胞系和癌症类型中的基因依赖性，并验证高通量或全基因组筛选的结果。
[背景] CRISPR / Cas9系统被认为已发展成为一种适应性的原核病毒防御系统（Mojica 等，2005； Makarova 等，2006）。它被发现后不久，就被研究人员选中，并进行了基因组编辑以供实验室使用（Doudna和Charpentier，2014年； Hsu 等人，2014年）。通过转基因表达Cas9核酸酶以及与靶序列互补的短链RNA（sgRNA），可以将双链断裂（DSB）引入各种细胞和生物体的目标位点（Cong 等，2013）。 ...
|
|
|