| Trypanosomatid, fluorescence-based in vitro U-insertion/U-deletion RNA-editing (FIDE)
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Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] Gene expression within the mitochondria of African trypanosomes and other protozoan organisms relies on a nucleotide-specific RNA-editing reaction. In the process exclusively uridine (U)-nucleotides are site-specifically inserted into and deleted from sequence-deficient primary transcripts to convert them into translatable mRNAs. The reaction is catalyzed by a 0.8 MDa multiprotein complex termed the editosome. Here we describe an improved in vitro test to quantitatively explore the catalytic activity of the editosome. The assay uses synthetic, fluorophore-derivatized oligoribonucleotides as ...
[摘要] [摘要]非洲锥虫和其他原生动物生物线粒体内的基因表达依赖于核苷酸特异性的RNA编辑反应。在该过程中，仅将尿苷（U）-核苷酸位点特异性插入序列不足的初级转录物中，并从中缺失，以将其转化为可翻译的mRNA。该反应由0.8 MDa的多蛋白复合物催化，该复合物被称为编辑体。在这里我们描述了一种改进的体外试验，以定量探索Editosome的催化活性。该测定使用合成的，荧光团衍生的寡核糖核苷酸 作为编辑底物，可通过耦合到激光诱导荧光（LIF）检测系统的毛细管电泳（CE）自动分离反应产物。该测定法功能强大，只需要纳克级的材料，并且通过使用多毛细管CE / LIF仪器，可以高度平行的方式进行测定。进一步的改进包括使用硫代磷酸酯修饰的，因此具有RNase耐性的底物RNA，以及用于同时监测U插入和U缺失反应的多重型荧光团标记策略。该测定方法对于研究酶体的机理和酶学是有用的。ħ H但是，它也可以在高通量执行以筛选RNA编辑特异性抑制剂。
图形摘要：
基于荧光的体外U插入/ U缺失RNA编辑（FIDE）分析的特征
[背景]中的RNA编辑反应动质体原生动物如非洲锥虫和利什曼原虫表示一个信使的最显着的转录后修饰（米）的RNA（综述Göringer ...
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| Plant ARGONAUTE Protein Immunopurification for Pathogen Cross Kingdom Small RNA Analysis
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Over the last decade, it has been noticed that microbial pathogens and pests deliver small RNA (sRNA) effectors into their host plants to manipulate plant physiology and immunity for infection, known as cross kingdom RNA interference. In this process, fungal and oomycete parasite sRNAs hijack the plant ARGONAUTE (AGO)/RNA-induced silencing complex to post-transcriptionally silence host target genes. We hereby describe the methodological details of how we recovered cross kingdom sRNA effectors of the oomycete pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis during infection of its host plant ...
[摘要] [摘要]在过去的十年中，已经注意到，微生物病原体和害虫将小RNA（sRNA）效应子传递到宿主植物中，以操纵植物生理学和免疫力，称为跨界RNA干扰。在此过程中，真菌和卵菌寄生虫sRNA劫持了植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合体，以转录后沉默宿主靶基因。我们在此描述方法学的细节，我们如何在宿主植物拟南芥感染期间恢复卵菌病原体拟南芥的跨界sRNA效应子。该生物协议包含两个部分：第一，关于植物AGO / sRNA co- 免疫纯化和sRNA回收，用于Illumina高通量测序分析。其次，我们解释了如何进行生物信息学小号斯尔纳序列分析读取可使用Galaxy服务器。原则上，该协议适用于研究来自多种宿主植物和植物相互作用（微生物）的AGO结合的sRNA。
[背景]小RNA（sRNA）可以充当病原体效应物，劫持植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合物（RISC），并使宿主mRNA沉默以进行感染，这种病毒被称为跨界RNA干扰的毒力机制（Weiberg等。，2015； Zeng等，2019）。分析感染期间与植物AGO结合的sRNA的库是一种选择方法，以全面了解可能通过宿主AGO / RISC起作用的植物入侵性病原体sRNA。基于抗体的植物AGO / ...
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| Isolation and Detection of the Chlorophyll Catabolite Hydroxylating Activity from Capsicum annuum Chromoplasts
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Hydroxylation of chlorophyll catabolites at the so-called C32 position (Hauenstein et al., 2016) is commonly found in all plant species analyzed to date. Here we describe an in vitro hydroxylation assay using Capsicum annuum chromoplast membranes as a source of the hydroxylating activity, which converts the substrate epi-pFCC (epi-primary Fluorescent Chlorophyll Catabolite) (Mühlecker et al., 2000) to epi-pFCC-OH.
[摘要] 所谓C32位置的叶绿素分解代谢物的羟基化（Hauenstein et al。，2016）通常在迄今为止分析的所有植物物种中发现。 在这里，我们描述了使用Capsicum annuum chromoplast membrane作为羟基化活性的来源的体外羟基化测定法，其将底物epi-pFCC（外显子荧光叶绿素Catabolite）（Mühlecker等，2000）转化为epi-pFCC-OH。
【背景】在叶片衰老和果实成熟期间，吸光叶绿素被降解成非荧光分解代谢物，以防止氧化损伤。叶绿素分解途径（PAO / phyllobilin途径）由几个酶催化的连续步骤组成，最终降解产物称为叶绿素，最终储存在液泡中（Kräutler，2016）。外源荧光叶绿素Cepolite（epi-pFCC）是第一种非光毒性中间体。在叶绿体中形成后，可以发生epi-pFCC的侧链修饰，其中大部分发生在叶绿体外。然而，这些修饰之一是由内部叶绿体包膜酶TIC55（铁氧还蛋白（Fd）依赖性非血红素加氧酶家族的成员）催化的C32位置（图1）的羟基化。 TIC55含有Rieske和单核铁结合结构域，并显示其需要Fd还原系统以及分子氧作为其羟基化活性。在这里我们描述了TIC55的体外酶测定法，其用于表征红辣椒色素体的表达pFCC羟基化酶活性。
图1.叶绿素分解途径的概述，突出了从epi-pFCC到epi-pFCC-OH的TIC55催化反应。 ...
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