Robust Generation of Knock-in Cell Lines Using CRISPR-Cas9 and rAAV-assisted Repair Template Delivery
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The programmable Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (Cas9) technology revolutionized genome editing by providing an efficient way to cut the genome at a desired location (Ledford, 2015). In mammalian cells, DNA lesions trigger the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism. However, in presence of a DNA repair template, Homology-Directed Repair (HDR) can occur leading to precise repair of the lesion site. This last process can be exploited to enable precise knock-in changes by introducing the desired genomic ...
[摘要] 可编程集群定期间隔短回归度(CRISPR)相关核酸酶9(Cas9)技术通过提供在所需位置切割基因组的有效方式,彻底改变了基因组编辑(Ledford,2015)。 在哺乳动物细胞中,DNA损伤触发易发生非同源末端连接(NHEJ)DNA修复机制。 然而,在DNA修复模板的存在下,可以发生同源性定向修复(HDR),导致病变部位的精确修复。 可以利用最后的方法,通过在修复模板上引入所需的基因组改变来实现精确的敲入变化。 在本协议中,我们描述了使用重组腺相关病毒(rAAV)在人细胞系中进行基于CRISPR-Cas9的C-末端标签序列敲入的长修复模板(> 200个核苷酸)的递送。
尽管有关CRISPR-Cas9产生的敲门模型系统的大量报告,敲门砖报告仍然落后。由于许多应用,产生敲入细胞系仍然是基因组编辑的明显目标。敲入改变的引入通常依赖于修复模板DNA的存在,并且在位点特异性双链(ds)DNA断裂被引入接近改变位点的基因组中后,HDR修复机制的激活。不同的模板可以传送到修复机器,范围从含有广泛同源区域和可选选择盒的经典线性化载体到约200个核苷酸的单链(ss)DNA寡核苷酸(Chen等人, ...
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Cell-based Assays to Monitor AID Activity
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Author:
Date:
2016-02-05
[Abstract] The enzyme Activation induced deaminase (AID) underpins antibody affinity maturation and isotype switching through its mutagenic activity of deaminating deoxycytidine to deoxyuridine in DNA. Subsequent processing of the deoxyuridine initiates the processes of somatic hypermutation (SHM) and class switch recombination (CSR) in B cells. Structure-function analysis of AID requires sensitive and biologically relevant methods to measure its various activities. Here we describe simple but effective methods to measure 1) the ability of AID to mutate the Escherichia coli genome, which ...
[摘要] 酶活化诱导的脱氨酶(AID)通过其将脱氧胞苷脱氨基到DNA中的脱氧尿苷的诱变活性来支持抗体亲和力成熟和同种型转换。脱氧尿苷的后续加工引发B细胞中体细胞超突变(SHM)和类型转换重组(CSR)的过程。 AID的结构功能分析需要灵敏和生物相关的方法来测量其各种活动。在这里我们描述简单但有效的方法来测量1)AID突变大肠杆菌基因组的能力,其提供其催化活性的指示; 2)AID通过补充DT40鸡B细胞系的衍生物来进行SHM的能力; 3)AID通过补充AID缺乏的原代小鼠B细胞来进行CSR的能力。三种方法的组合,伴随着AID亚细胞定位和蛋白质表达水平和稳定性的必要分析作为对照,允许AID的详细结构功能研究。
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