| Digestion of Peptidoglycan and Analysis of Soluble Fragments
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Peptidoglycan (murein) is a vital component of the cell wall of nearly all bacteria, composed of sugars linked by short peptides. This protocol describes the purification of macromolecular peptidoglycan from cultured bacteria and the analysis of enzyme-digested peptidoglycan fragments using high performance liquid chromatography (HPLC). Digested peptidoglycan fragments can be identified by mass spectrometry, or predicted by comparing retention times with other published chromatograms. The quantitative nature of this method allows for the measurement of changes to peptidoglycan composition ...
[摘要] 肽聚糖（murein）是由短肽连接的糖组成的几乎所有细菌的细胞壁的重要组成部分。 该方案描述了从培养细菌中纯化大分子肽聚糖和使用高效液相色谱（HPLC）分析酶消化的肽聚糖片段。 消化的肽聚糖片段可以通过质谱鉴定，或通过比较保留时间与其他公开的色谱图预测。 该方法的定量性质允许测量不同种类的细菌，生长条件或突变之间肽聚糖组成的变化。 该方法可以确定肽聚糖的总体结构，如肽长度，交联程度和修饰。 已经使用神经肽分析来研究肽聚糖相关蛋白的功能和细菌获得抗生素抗性的机制。
【背景】肽聚糖由通过肽干连接在一起的糖骨架组成，其产生对细胞形状重要的网状结构和细菌细胞的膨胀压力。大分子肽聚糖从在细胞质中合成的单体单元组装，并由具有5个氨基酸的茎组成的具有5个氨基酸的葡萄糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖二糖组成。当单体翻转到周质中时，通过反式糖基化将其加入到聚糖链中，并且通过转肽酶将一部分肽茎连接在一起。
＆NBSP;包含肽干的氨基酸可以根据物种变化，但通常以L-丙氨酸，D-谷氨酸，内消旋二氨基庚二酸，D-丙氨酸，D-丙氨酸，丙氨酸，在一些革兰氏阳性中，L-赖氨酸代替二氨基庚二酸。通过直接或通过连接氨基酸连接第三或第四氨基酸的第三个氨基酸的游离胺进行交联（Schleifer和Kandler，1972）。其他常见的修饰包括氨基酸的酰胺化（Kato和Strominger，1968）和O-乙酰化（Clarke和Dupont，1992）或者N-脱乙酰化（Araki ...
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| Isolation and Infection of Drosophila Primary Hemocytes
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Phagocytosis of invading pathogens and their subsequent clearance in lysosomes is important for organismal fitness. We have devised the following protocol to extract phagocytic hemocytes from wild-type and mutant Drosophila larvae and infect the isolated hemocytes with GFP-labeled E. coli to measure the rate of phagocytosis and degradation within individual hemocytes over time.
[摘要] 入侵病原体的吞噬作用及其随后在溶酶体中的清除对于有机体适应性是重要的。我们设计了以下方案从野生型和突变型果蝇幼虫中提取吞噬性血细胞，并用GFP标记的E感染分离的血细胞。大肠杆菌以测量个体血细胞内吞噬和降解的速度。
背景 下面描述的实验可用于研究吞噬体的生物发生，成熟和向溶酶体的递送。细菌积累已经在免疫受损的果蝇的背景下得到充分的研究，其具有IMD或Toll信号传导中的缺陷，并导致抗微生物肽的表达降低（例如，Lemaitre和Hoffmann ，2007; Kleino和Silverman，2014）。细菌感染的细胞响应在果蝇中的研究较少，大多数研究集中于干扰血细胞对细菌的最初吞噬吞噬的突变（Kocks等人，2005年） ;帕森斯和福利，2016）。这种细菌摄取是直接使用FACS分析进行测量（Tirouvanziam等人，2004）。然而，对于吞噬体成熟的详细分析，我们发现检查附着在玻璃盖板上的个体血细胞是有利的（Akbar等人，2011; Rahman等人。 ，2012; Akbar等人，2016），因为这个过程为我们研究吞噬体成熟提供了时间和空间分辨率的最佳组合。
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| Nuclei Isolation from Nematode Ascaris
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Preparing nuclei is necessary in a variety of experimental paradigms to study nuclear processes. In this protocol, we describe a method for rapid preparation of large number of relatively pure nuclei from Ascaris embryos or tissues that are ready to be used for further experiments such as chromatin isolation and ChIP-seq, nuclear RNA analyses, or preparation of nuclear extracts (Kang et al., 2016; Wang et al., 2016).
[摘要] 在各种实验范例中准备核是必要的，以研究核过程。在本协议中，我们描述了一种从准备用于进一步实验（如染色质分离和ChIP-seq，核RNA）的蛔虫胚胎或组织快速制备大量相对纯的核的方法分析或准备核提取物（Kang等人，2016; Wang等人，2016）。
背景 核分离通常是研究核事件的分子和生物化学方面的第一步。已经开发了几种方法来分离来自不同组织和细胞类型的细胞核。然而，除了C以外的线虫的细胞核分离方案很少。已经描述了线索，（Ooi等人，2010; Zanin等人，2011; Haenni等人，2012， ）。已经使用寄生线虫蛔虫的胚胎来制备用于体外无细胞系统的各种提取物（Cohen等人，2004） ; Lall等人，2004）。然而，这些提取物通常是全细胞提取物。在这里，我们描述了从线虫蛔虫制备细胞核的方法。
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