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Date:
2017-04-20
[Abstract] This protocol describes how to measure protein-protein interactions by microscale thermophoresis (MST) using the MonolithTM NT.115 instrument (NanoTemper). We have used the protocol to determine the binding affinities between three different flavodoxin reductases (FNRs) and a flavodoxin-like protein, NrdI, from Bacillus cereus (Lofstad et al., 2016). NrdI is essential in the activation of the manganese-bound form of the class Ib ribonucleotide reductase (RNR) system. RNRs, in turn, are the only source of the de novo synthesis of deoxyribonucleotides ...
[摘要] 该协议描述了如何使用Monolith TM NT.115仪器（NanoTemper）通过微量热泳法（MST）测量蛋白质 - 蛋白质相互作用。我们已经使用方案来确定三种不同的黄素氧还蛋白还原酶（FNR）和来自蜡样芽孢杆菌（Lofstad等）的黄素氧还蛋白样蛋白NrdI之间的结合亲和力， 2016）。 NrdI对于Ib类核糖核苷酸还原酶（RNR）系统的锰结合形式的活化至关重要。反过来，RNRs是所有生物体中DNA复制和修复所需的脱氧核糖核苷酸合成的唯一来源。
蛋白质 - 蛋白质的相互作用通常以相关的解离常数（K D ）为特征。可以使用诸如等温量热法（ITC），NMR光谱和表面等离子体共振（SPR）的各种技术来建立结合常数。另一种方法是基于热泳法，其中不同分子（例如蛋白质 - 蛋白质复合物与单个蛋白质）对温度梯度的反应不同（Duhr和Braun，2006; Seidel等人， 2013）。该方法快速，不需要样品固定，样品要求较低。简言之，其中一种蛋白质用荧光染料标记并保持在恒定的低浓度。建立稀释系列，其他蛋白质稀释至16倍，产生广泛的浓度范围。随后将两种蛋白质混合并加载到毛细管中，毛细管在Monolith TM ...
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