| Xenopus laevis Oocytes Preparation for in-Cell EPR Spectroscopy
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] One of the most exciting perspectives for studying bio-macromolecules comes from the emerging field of in-cell spectroscopy, which enables to determine the structure and dynamics of bio-macromolecules in the cell. In-cell electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy in combination with micro-injection of bio-macromolecules into Xenopus laevis oocytes is ideally suited for this purpose. Xenopus laevis oocytes are a commonly used eukaryotic cell model in different fields of biology, such as cell- and development-biology. For in-cell EPR, the bio-macromolecules of ...
[摘要] 研究生物大分子的最令人兴奋的观点之一来自于新兴的细胞内光谱学领域，它能够确定细胞中生物大分子的结构和动力学。细胞内电子顺磁共振（EPR）光谱结合将生物大分子微注射到非洲爪蟾卵母细胞中非常适合于此目的。非洲爪蟾卵母细胞是生物学不同领域常用的真核细胞模型，如细胞和发育生物学。对于细胞内EPR，感兴趣的生物大分子通过定点自旋标记显微注射到非洲爪蟾卵母细胞中。通过Nanoliter注射器将样品溶液填充到薄玻璃毛细管中，然后通过小心地穿刺薄膜将其微注射入非洲爪蟾卵母细胞的黑色动物部分。之后，取决于最终的细胞内EPR实验的种类，将三个或五个显微注射的非洲爪蟾卵母细胞装载到Q波段EPR样品管中，随后进行任选的休克冷冻（用于实验冷冻溶液）并且在期望的温育时间之后测量（在低温或生理温度下）。由于显微注射样品的细胞毒性作用和顺磁性自旋标记在还原性细胞环境中的稳定性，孵育时间受到限制。通过监测细胞形态和减少动力学来量化这两个方面。
【背景】电子顺磁共振（EPR）光谱学是用于表征顺磁系统的选择方法（Atherton，1993; Gerson等人，1994; Jeschke和Schweiger，2001）。反磁性生物大分子可以通过定点自旋标记（SDSL）进行EPR光谱学分析，通常使用氮氧化物作为自旋标记（Hubbell和Altenbach，1994; Feix和Klug，2002; ...
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| Boron Uptake Assay in Xenopus laevis Oocytes
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Boron (B) is essential for plant growth and taken up by plant roots as boric acid. Under B limitation, B uptake and translocation in plants are dependent on the boric acid channels located in the plasma membrane. Xenopus leavis oocyte is a reliable heterologous expression system to characterize transport activities of boric acid channels and related major intrinsic proteins (aquaporins). Here, we outline the protocols for expression of boric acid channels and boric acid uptake assay in Xenopus leavis oocytes.
[摘要] 硼（B）对植物生长至关重要，并被植物根部吸收为硼酸。 在B限制下，植物中的B吸收和转运依赖于位于质膜中的硼酸通道。 非洲爪蟾卵母细胞是一种可靠的异源表达系统，用于表征硼酸通道和相关主要内在蛋白（水通道蛋白）的运输活性。 在这里，我们概述了在非洲爪蟾卵母细胞中表达硼酸通道和硼酸摄取测定的方案。
【背景】硼对植物生长是必不可少的，但是它在积累时是有毒的。硼通过鼠李糖聚半乳糖醛酸II区果胶多糖的交联在细胞壁中具有结构功能（Funakawa和Miwa，2015）。在溶液中，B主要以生理pH下的硼酸形式存在[B（OH）3 H 2 O 2 B（OH）4] + - （p k a = 9.24）]。硼酸是一种小的中性分子，因此在生物膜上显示出显着的被动扩散（Dordas等人，2000）。此外，植物利用属于主要内在蛋白质（MIP，水通道蛋白）家族的硼酸通道和硼酸盐出口者（BOR家族）来维持B体内平衡（Takano等人，2008）。
最初，玉米PIP1在非洲爪蟾卵母细胞中表达并且显示出促进硼酸摄入比注水卵母细胞高30％（Dordas et al。 2000>）。然后，显示拟南芥NIP5; 1促进硼酸摄取比注水卵母细胞高5至9倍（Takano等人，2006）。与发现缺乏NIP5; ...
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| Drosophila Model of Leishmania amazonensis Infection
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] This protocol describes how to generate and harvest antibody-free L. amazonensis amastigotes, and how to infect adult Drosophila melanogaster with these parasites. This model recapitulates key aspects of the interactions between Leishmania amastigotes and animal phagocytes.
[摘要] 该协议描述了如何产生和收获无抗体的L型。 amazonensis amastigotes，以及如何用这些寄生虫感染成年果蝇（Drosophila melanogaster）。 这个模型概括了利什曼原虫和动物吞噬细胞之间相互作用的关键方面。
【背景】由利什曼原虫引起的利什曼病，根据宿主的寄生虫种类和免疫状态，影响皮肤，粘膜或内脏器官。 尽管小鼠感染模型已经提供了我们对这种寄生虫感染的大部分了解，但它并不适合于大规模的探索性方法。 在我们的实验室，我们利用果蝇黑腹果蝇的易处理和强大的遗传学来建立利什曼原虫感染的模型并进行小规模的筛选来鉴定涉及的宿主基因 在这些寄生虫的吞噬中（Okuda等人，2016）。 具体而言，使用UAS-GAL4表达系统（Brand和Perrimon，1993），可能与吞噬作用相关的一组基因被特异性敲低，监测突变体感染的苍蝇的存活和寄生物负荷以鉴定 调节感染的因素。
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