| Staining of Membrane Receptors with Fluorescently-labeled DNA Aptamers for Super-resolution Imaging
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] One of the most prominent applications of fluorescent super-resolution microscopy is the study of nanodomain arrangements of receptors and the endocytic pathway. Staining methods are becoming crucial for answering questions on the nanoscale, therefore, the use of small and monovalent affinity probes is of great interest in super-resolution microscopy with biological samples. One kind of affinity probe is the aptamer. Aptamers are single DNA or RNA sequences that bind with high affinity to their targets and due to their small size they are able to (i) place the fluorophore in close proximity ...
[摘要] 荧光超分辨率显微镜的最突出的应用之一是研究纳米结构的受体和内吞途径。染色方法对于回答纳米尺度的问题变得至关重要，因此，使用小型和单价亲和探针在具有生物样品的超分辨显微镜中是非常有意义的。一种亲和力探针是适体。适配体是以高亲和力结合其靶标的单个DNA或RNA序列，并且由于它们的小尺寸，它们能够（i）将荧光团置于感兴趣的蛋白质附近，并且（ii）与大部分蛋白质结合有利于克服空间位阻效应，导致更好的染色密度。在这里，我们描述一个详细的协议，使用适配体染色活细胞，并用刺激的排放消耗（STED）显微镜对其进行成像。在该方案中，染色用市售适用于靶向表皮生长因子受体（EGFR），人表皮生长因子受体2（HER2或ErbB2）和ephrin-A受体2（Epha2）的适体进行。由于适配体可与大部分受欢迎的荧光团偶联，因此我们认为本文介绍的方法可扩展到目前超分辨率显微镜技术的绝大多数。
【背景】超分辨率成像技术的最新进展已经导致搜索更精确的方法来标记细胞元件。衍射无限成像仪器提供优异的分辨率，然而标准样品染色方法，如免疫染色，缺乏检测细胞元素所必需的精度。由于它们的大尺寸（长度约15nm）和高分子量（〜150kDa），抗体可以很差地渗透到生物样品中。另外，一次/二次抗体复合物将荧光团放置在远离靶的大约25nm处，从而损害检测精度。此外，由于初级/二级抗体复合物的大尺寸，由于空间位阻（Fornasiero和Opazo，2015），较小部分的靶标可以被标记。这导致较低的标记密度，这是超分辨率显微镜的关键参数，特别是在识别和描述纳米结构时。为了克服这些问题，近年来已经测试了与单个靶（单价）结合的小的亲和力探针，如适体，亲和体或纳米体系（Rothbauer ...
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| Melanoma Stem Cell Sphere Formation Assay
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Self-renewal is the ability of cells to replicate themselves at every cell cycle. Throughout self-renewal in normal tissue homeostasis, stem cell number is maintained constant throughout life. Cancer stem cells (CSCs) share this ability with normal tissue stem cells and the sphere formation assay (SFA) is the gold standard assay to assess stem cells (or cancer stem cells) self-renewal potential in vitro. When single cells are plated at low density in stem cell culture medium, only the cells endowed with self-renewal are able to grow in tridimensional clusters usually named spheres. ...
[摘要] 自我更新是细胞在每个细胞周期复制自身的能力。在正常组织体内平衡的自我更新过程中，干细胞数量在整个生命中保持不变。癌症干细胞（CSCs）与正常组织干细胞共享这种能力，球形成测定（SFA）是评估干细胞（或癌症干细胞）体外自我更新潜力的金标准测定方法。 。当单细胞在干细胞培养基中以低密度铺板时，仅具有自我更新的细胞能够在通常称为球体的三维簇中生长。近年来，SFA也用于测试几种药物，化学和天然化合物或微环境成分对干细胞自我更新能力的影响。在这里，我们将说明一个详细的方案来评估人类黑色素瘤干细胞的自我更新，作为黑色球体生长。
癌症干细胞（CSCs）首先在急性骨髓瘤白血病（Lapidot et al。，1994）中发现，然后在许多实体瘤中鉴定出包括黑素瘤。 CSCs被定义为具有自我更新和肿瘤起始能力的细胞，能够在体内再生整个肿瘤异质性。可以使用基于表型特征或生物学特性的不同方法从肿瘤块中分离CSCs，然后在体外（自我更新）和体内 （致瘤潜力）。使用细胞表面标志物的组合分离黑素瘤CSCs（Fang等人，2005; Monzani等人，2007; Schatton等人， ，2008; Boiko等人，2010; Boonyaratanakornkit等人，2010）或通过特定干细胞培养基中的培养（Perego等人， ，2010; Santini ...
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