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Date:
2017-04-20
[Abstract] Methods that allow the study of gene expression regulation are continually advancing. Here, we present an in situ hybridization protocol capable of detecting individual mRNA molecules in plant root cells, thus permitting the accurate quantification and localization of mRNA within fixed samples (Duncan et al., 2016; Rosa et al., 2016). This single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) uses multiple single-labelled oligonucleotide probes to bind target RNAs and generate diffraction-limited signals that can be detected using a wide-field ...
[摘要] 允许研究基因表达调控的方法不断前进。在这里，我们提出了一种能够检测植物根细胞中单个mRNA分子的原位杂交方案，从而允许mRNA在固定样品内的准确定量和定位（Duncan等人， ，2016; Rosa等人，2016）。这种单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）使用多个单标记寡核苷酸探针结合靶RNA并产生可以使用宽场荧光显微镜检测的衍射限制信号。我们调整了该方法的最新版本，该方法使用48个荧光标记的DNA寡核苷酸（20个）与每个转录物的不同部分杂交（Raj等人，2008）。这种方法简单易行，具有很好的应用于任何遗传背景的优点。
虽然已经开发了单分子FISH来定量测量培养细胞，组织切片和整体无脊椎动物生物体的单细胞水平的mRNA，但该方法未被优化用于植物中的单细胞。由于植物组织的内源性自发荧光，植物中的荧光成像是相当有挑战性的。在这里，我们报告一种检测植物中单RNA分子的方法。我们描述在固定的拟南芥根瘤胃细胞内的单一转录物的检测和自动计数。该方法产生隔离的单元和单细胞层，其与红色和远红色染料一起使用可以最大化限制背景噪声的信噪比。
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