| Probe-Seq: Method for RNA Sequencing of Specific Cell Types from Animal Tissue
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Most organs and tissues are composed of many types of cells. To characterize cellular state, various transcription profiling approaches are currently available, including whole-tissue bulk RNA sequencing, single cell RNA sequencing (scRNA-Seq), and cell type-specific RNA sequencing. What is missing in this repertoire is a simple, versatile method for bulk transcriptional profiling of cell types for which cell type-specific genetic markers or antibodies are not readily available. We therefore developed Probe-Seq, which uses hybridization of gene-specific probes to RNA markers for isolation of ...
[摘要] [摘要 ] 大多数器官和组织由许多类型的细胞组成。为了表征细胞状态，目前可以使用各种转录分析方法，包括全组织体RNA测序，单细胞RNA测序（scRNA -Seq）和特定于细胞类型的RNA测序。在此库中缺少的是一种简单，通用的方法，无法批量获得细胞类型的特定基因标记或抗体，因此无法批量转录。因此，我们开发了Probe-Seq，该探针使用基因特异性探针与RNA标记的杂交来分离特定类型的细胞，以实现下游FACS分离和大量RNA测序。我们表明，该方法可以实现从小鼠视网膜，冷冻人视网膜，果蝇中肠和发育中的雏鸡视网膜中分离和分析特定细胞类型的特征，这表明它对大多数生物很有用。
[背景技术 [ 0002 ] 在过去的二十年中，使用RNA-Seq和微阵列进行转录谱分析已在生物学研究中无处不在。分析现在是用来了解大多数生物体中细胞和细胞状态的主要工具之一。它被用于正常发育，异常发育和疾病的研究，并极大地扩展了我们对进化关系的理解。特别地，scRNA- Seq已经以前所未有的速度导致了新型细胞类型的鉴定（Picelli 等，2013；Jaitin 等，2014； Klein 等，2015； Macosko 等，2015）。为了更深入地了解这些新描述的细胞类型，一种无需转基因标记或特异性抗原即可将其分离的方法将大有裨益。尽管可以使用scRNA ...
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| Low-input Capture-C: A Chromosome Conformation Capture Assay to Analyze Chromatin Architecture in Small Numbers of Cells
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Chromosome conformation capture (3C) techniques are crucial to understanding tissue-specific regulation of gene expression, but current methods generally require large numbers of cells. This protocol describes two new low-input Capture-C approaches that can generate high-quality 3C interaction profiles from 10,000-20,000 cells, depending on the resolution used for analysis.
[摘要] 染色体构象捕获（3C）技术对于理解基因表达的组织特异性调节是至关重要的，但是目前的方法通常需要大量的细胞。 该协议描述了两种新的低输入Capture-C方法，根据用于分析的分辨率，可以从10,000-20,000个细胞生成高质量的3C相互作用谱。
【背景】3C技术在调查调控元件之间的核组织和结构相互作用与基因活性之间起关键作用（Dekker等人，2002）。 由于这些相互作用是高度组织特异性的，3C定义的纯化细胞群进行3C实验是至关重要的。
3C技术的一个主要局限性是所需要的大量细胞：目前的方法使用了10万到10万个细胞（Davies等人，2017）。 这些数字中不包含许多原发性组织和稀有细胞群。 因此，我们开发了两种新的低输入Capture-C方法，可以从最大分辨率的〜20,000个细胞（单独的DpnII片段）和使用基于开窗分析的约10,000个细胞产生高质量的相互作用谱（Oudelaar等人 。，2017）。
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| Single-molecule RNA Fluorescence in situ Hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a technique to visualize individual RNA molecules using multiple fluorescently-labeled oligonucleotide probes specific to the target RNA (Raj et al., 2008; Lee et al., 2016a). We adapted this technique to visualize RNAs in the C. elegans whole adult worm or its germline, which enabled simultaneous recording of nascent transcripts at active transcription sites and mature mRNAs in the cytoplasm (Lee et al., 2013 and 2016b). Here we describe each step of the smFISH procedure, reagents, ...
[摘要] 单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）是使用针对靶RNA特异性的多个荧光标记寡核苷酸探针来观察个体RNA分子的技术（Raj等人，2008; Lee等，2016a）。 我们调整了这种技术可视化线虫整个成虫或其种系中的RNA，其能够同时记录活跃转录位点的新生转录物和细胞质中的成熟mRNA（Lee等，2013和2016b）。 在这里，我们描述针对秀丽隐杆线虫挤压性腺优化的smFISH程序，试剂和显微镜设置的每个步骤。
【背景】smFISH能够在体内直接和精确地定量mRNA。 此外，通过复用smFISH探针，可以在同一细胞中同时测定多个RNA物种。 以前的出版物在线虫中使用了smFISH，但是这些研究使用了宽视野显微镜，其通常具有较低的空间分辨率并需要额外的图像处理（例如，图像去卷积）（Ji和van Oudenaarden，2012）。 在这里，我们描述了针对秀丽隐杆线虫组织优化的smFISH程序。 每个步骤都是详细的，包括使用共焦显微镜来获得精确的测量。 我们的协议最大限度地减少了样品与样品的变异性，并允许精确定量mRNA和新生转录物。
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