A Novel Method to Construct Binary CRISPR Vectors for Plant Transformation by Single Round of PCR Amplification
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] CRISPR/Cas9 is an established and flexible tool for genome editing. However, most methods used to generate expression clones for the CRISPR/Cas9 are time-consuming. Hence, we have developed a one-step protocol to introduce sgRNA expression cassette(s) directly into binary vectors (Liu et al., 2020). In this approach, we have optimized the multiplex PCR to produce an overlapping PCR product in a single reaction to generate the sgRNA expression cassette. We also amplified two sgRNA expression cassettes through a single round of PCR. Then, the sgRNA expression cassette(s) is cloned into the ...
[摘要] [摘要] CRISPR / Cas9是一种成熟且灵活的基因组编辑工具。但是,大多数用于生成CRISPR / Cas9表达克隆的方法都很耗时。因此,我们开发了一种将sgRNA表达盒直接引入二元载体的一步协议(Liu等人,2020年)。在这种方法中,我们优化了多重PCR,以在单个反应中产生重叠的PCR产物,从而生成sgRNA表达盒。我们还通过单轮PCR扩增了两个sgRNA表达盒。然后,在Gateway LR或Golden gate反应中将sgRNA表达盒克隆到二元载体中。本文报道的系统为构建用于CRISPR / Cas9介导的基因组编辑的表达克隆提供了更有效,更简单的程序。在此协议中,我们描述了使用此系统的详细分步说明。
[背景]乙acteria保卫针对病毒通过蛋白系统,由群集规则间隔开的短回文重复序列(CRISPR)中,CRISPR相关(CAS)蛋白质,CRISPR的RNA(crRNAs)和反式编码crRNA(tracrRNA)。现在,研究人员已经将其系统开发为用于靶向基因组编辑的关键工具。CRISPR –二元载体表达两个元素–具有靶序列的sgRNA(target-sgRNA)和Cas9蛋白–切割靶基因组区域。冯等人。(2013年)已经构建了网关载体,通过农杆菌介导的转化在植物中共表达Cas9和sgRNA ...
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Method for Multiplexing CRISPR/Cas9 in Saccharomyces cerevisiae Using Artificial Target DNA Sequences
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Date:
2017-09-20
[Abstract] Genome manipulation has become more accessible given the advent of the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) editing technology. The Cas9 endonuclease binds a single stranded (single guide) RNA (sgRNA) fragment that recruits the complex to a corresponding genomic target sequence where it induces a double stranded break. Eukaryotic repair systems allow for the introduction of exogenous DNA, repair of existing mutations, or deletion of endogenous gene products. Targeting of Cas9 to multiple genomic positions (termed ‘multiplexing’) is achieved by the expression of ...
[摘要] 鉴于CRISPR(集群定期间隔短回归重复)编辑技术的出现,基因组操纵变得更加易于使用。 Cas9核酸内切酶将募集复合物的单链(单向导)RNA(sgRNA)片段结合到相应的基因组靶序列,引发双链断裂。真核修复系统允许引入外源DNA,修复现有突变或内源基因产物的缺失。通过在同一核内表达多个sgRNA来实现Cas9对多个基因组位置的定位(称为“多重”)。然而,CRISPR领域的持续关注是将Cas9意外地定位到基因组内的替代(“脱靶”)DNA位置。我们将安装的人造Cas9靶序列的使用(称为人造基因座上的Cas9复制)描述为允许(i)与单个sgRNA复用的酵母基因组中的用途; (ii)减少/消除可能的脱靶效应,以及(iii)精确控制预定目标序列的放置。 【背景】CRISPR(集群定期间隔回归重复)机制已经在原核生物中演变为具有很高精度编辑任何基因组的能力的原始适应性免疫系统(Jinek等,2012; Sorek等,2013)。这种生物技术需要使用来自化脓性链球菌(或othologous物种)的内切核酸酶(Cas9),单个RNA'引导'序列和外源供体DNA(如果需要)。仅在短短几年内,CRISPR / ...
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CRISPR/Cas9 Editing of the Bacillus subtilis Genome
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] A fundamental procedure for most modern biologists is the genetic manipulation of the organism under study. Although many different methods for editing bacterial genomes have been used in laboratories for decades, the adaptation of CRISPR/Cas9 technology to bacterial genetics has allowed researchers to manipulate bacterial genomes with unparalleled facility. CRISPR/Cas9 has allowed for genome edits to be more precise, while also increasing the efficiency of transferring mutations into a variety of genetic backgrounds. As a result, the advantages are realized in tractable organisms and ...
[摘要] 大多数现代生物学家的基本过程是研究生物体的遗传操作。尽管许多不同的方法用于编辑细菌基因组已经在实验室中使用了数十年,但CRISPR / Cas9技术对细菌遗传学的适应使得研究人员能够以无与伦比的设施来操纵细菌基因组。 CRISPR / Cas9允许基因组编辑更精确,同时也提高将突变转移到各种遗传背景的效率。因此,在遗传操作难以处理的易处理生物和生物体中实现了这些优点。在这里,我们描述了我们编辑枯草芽孢杆菌细菌基因组的方法。我们的方法是高效的,导致精确,无标记的突变。此外,在产生编辑质粒之后,可以将突变快速导入几个遗传背景,大大增加可进行遗传分析的速度。
枯草芽孢杆菌是高度易处理的革兰氏阳性菌。遗传研究适用于使用多种载体通过同源重组快速有效地引入突变。尽管有许多不同的方法来引入B突变。 subtilis,每种方法都有其局限性。一种简单而简单的方法,用于在B中进行突变。枯草芽孢杆菌是基因破坏,其中将质粒整合到感兴趣的基因内(Vagner等人,1998)。主要的局限性包括:1)扰乱操纵子的极地作用的潜力; 2)引进和保留外来DNA; 3)一旦使用抗生素耐药性盒,如果在其他突变的背景下研究给定的突变,则研究者必须使用不同的盒;和4)该方法限于靶向整个基因,并且不能产生更精确的点突变。 ...
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