| 3D Culture Protocol for Testing Gene Knockdown Efficiency and Cell Line Derivation
|
|
Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Traditional 2D cell cultures with cells grown as monolayers on solid surface still represent the standard method in cancer research for drug testing. Cells grown in 2D cultures, however, lack relevant cell-matrix and cell-cell interactions and ignore the true three-dimensional anatomy of solid tumors. Cells cultured in 2D can also undergo cytoskeletal rearrangements and acquire artificial polarity associated with aberrant gene expression (Edmondson et al., 2014). 3D culture systems that better mimic the in vivo situation have been developed recently. 3D in vitro ...
[摘要] 细胞在固体表面生长为单层的传统二维细胞培养仍然代表了药物检测癌症研究的标准方法。然而，在2D培养物中生长的细胞缺乏相关的细胞基质和细胞 - 细胞相互作用，并且忽略实体肿瘤的真实三维解剖结构。在2D中培养的细胞也可经历细胞骨架重排并获得与异常基因表达相关的人造极性（Edmondson等人，2014）。最近开发出更好地模拟体内情况的3D文化系统。用于研究癌症干细胞的3D体外肿瘤模型（肿瘤球体）在该领域已经获得了越来越多的普及（Weiswald等人，2015）。使用基质嵌入或封装的球体，悬滴培养的球体，磁悬浮系统或3D打印方法的系统已经广泛用于研究和新药筛选。在本文中，我们描述了测试shRNA介导的基因沉默对肿瘤球体形成和生长的影响的详细方案。这种方法允许研究人员测试基因敲低对肿瘤起始细胞生长的影响。正如我们实验室所证实的那样，该方案也可用于直接从肿瘤组织中分离3D癌细胞系。
【背景】3D体外肿瘤细胞模型代表了细胞系与体内生长的肿瘤之间的桥接实验方法（Pampaloni等人，2007; ...
|
|
|
| A Novel Protocol to Quantitatively Measure the Endocytic Trafficking of Amyloid Precursor Protein (APP) in Polarized Primary Neurons with Sub-cellular Resolution
|
|
Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Alzheimer’s disease’s established primary trigger is β-amyloid (Aβ) (Mucke and Selkoe, 2012). The amyloid precursor protein (APP) endocytosis is required for Aβ generation at early endosomes (Rajendran and Annaert, 2012). APP retention at endosomes depends on its sorting for degradation in lysosomes (Haass et al., 1992; Morel et al., 2013; Edgar et al., 2015; Ubelmann et al., 2017). The following endocytosis assay has been optimized to assess the amyloid precursor protein (APP) endocytosis and degradation by live murine cortical primary neurons (Ubelmann et ...
[摘要] 阿尔茨海默病确定的主要触发因素是β-淀粉样蛋白（Aβ）（Mucke和Selkoe，2012）。 淀粉样蛋白前体蛋白（APP）内吞作用是在早期内体中产生Aβ所必需的（Rajendran和Annaert，2012）。 内涵体上的APP保留取决于其对溶酶体中的降解的分选（Haass等人，1992; Morel等人，2013; Edgar等人， 2015年; Ubelmann等人，2017年）。 已经优化了以下内吞作用测定法以评估活的小鼠皮层原代神经元的淀粉状蛋白前体蛋白（APP）内吞作用和降解（Ubelmann等人，2017）。
【背景】Aβ42积聚是阿尔茨海默病的主要触发因素。 APP的胞吞作用需要Aβ42代（辜和Squazzo，1994; Grbovic 等人，2003; Cirrito 等人，2008;拉金德伦等人，2008）。已经通过表面蛋白的经典生物素化在脉冲追踪动力学实验中分析了APP的内吞作用（Sannerud等人，2011; Xiao等人，2012; Sullivan等人，2014），在单细胞中通过使用针对APP的N-末端胞外结构域的抗体（Yamazaki等人，1995; Xiao ，2012）。这些研究中的大多数使用非神经元细胞（Yamazaki等人，1996; Lee等人，2008; Sullivan等人， ...
|
|
|
| Measuring the Endocytic Recycling of Amyloid Precursor Protein (APP) in Neuro2a Cells
|
|
Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] The established primary trigger of Alzheimer’s disease’s is β-amyloid (Aβ) (Mucke and Selkoe, 2012). Amyloid precursor protein (APP) endocytosis is required for Aβ generation at early endosomes (Rajendran and Annaert, 2012). APP retention at endosomes also depends on its recycling back to the plasma membrane (Koo et al., 1996; Ubelmann et al., 2017). The following recycling assay has been optimized to assess APP recycling by live murine Neuro2a cells, a neuroblastoma cell line (Ubelmann et al., 2017).
[摘要] 已确定的阿尔茨海默病的主要诱因是β-淀粉样蛋白（Aβ）（穆克和Selkoe，2012）。淀粉样蛋白前体蛋白（APP）胞吞作用是早期内涵体产生Aβ所必需的（核内体中的APP保留还取决于其回到质膜的再循环（Koo等人，1996; Rajendran和Annaert，2012）。 Ubelmann等人，2017）。已经优化了以下回收测定法以评估活的小鼠神经母细胞瘤细胞系具有Neuro2a细胞（Ubelmann等人，2017）的APP回收。
【背景】Aβ42积聚是阿尔茨海默病的主要触发因素，APP的胞吞作用需要Aβ42代（辜和Squazzo，1994; Grbovic等人，2003; Cirrito等人，2008;拉金德伦等人，2008）内吞作用后，APP可以循环回到质膜上，可能会逃避内体的处理虽然许多研究表征了APP内吞作用，但需要建立调节。 APP回收的机制。因此，强有力的，敏感的和定量的测定是必要的。已经通过免疫荧光和定量地使用表面蛋白的批量生物素化，随后追逐内吞作用和剥离或阻断表面蛋白后的循环追踪，定性地评估APP回收（辜等，1996; Yamazaki，1996; Chaufty等，2012）。
我们使用经典的免疫荧光和半定量的细胞生物学方法，开发了用于跟踪和测量具有Neuro2a细胞中的APP回收的方法。我们的测定依赖于用红色荧光蛋白（RFP）标记的APP的瞬时表达，以检测和定量APP的细胞库和使用针对APP胞外域的抗体来选择性检测和定量表面池的运输的APP。 ...
|
|
|