| RNA Degradation Assay Using RNA Exosome Complexes, Affinity-purified from HEK-293 Cells
|
|
Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] The RNA exosome complex plays a central role in RNA processing and regulated turnover. Present both in cytoplasm and nucleus, the exosome functions through associations with ribonucleases and various adapter proteins (reviewed in [Kilchert et al., 2016]). The RNA exosome-associated EXOSC10 protein is a distributive, 3’-5’ exoribonuclease. The following protocol describes an approach to monitor the ribonucleolytic activity of affinity-purified EXOSC10-containing RNA exosomes, originating from HEK-293 cells, as reported in (Domanski et al., 2016) and further detailed in the ...
[摘要] RNA外植体复合物在RNA加工和调节营养中起核心作用。在细胞质和细胞核中存在，外来体通过与核糖核酸酶和各种衔接蛋白的关联起作用（参见[Kilchert等人，2016]）。 RNA外植体相关的EXOSC10蛋白是分布的3'-5'外核糖核酸酶。以下方案描述了监测源自HEK-293细胞的亲和纯化含EXOSC10的RNA外来体的核糖核酸裂解活性的方法，如（Domanski等人，2016）所报道的，并进一步详细描述这个配套生物协议（Domanski和LaCava，2017）。
在我们以前的工作中，我们在四环素诱导型CMV启动子（HEK-293 Flp-In T-REx-Thermo）的控制下，建立了表达C末端3xFLAG标记的外来体成分EXOSC10（RRP6）的同基因HEK-293细胞系费雪科学）。该系统允许我们以与内源WT蛋白质相当的水平表达标记的EXOSC10蛋白质，并且使用磁性抗FLAG亲和介质和来源于冷冻细胞粉末的蛋白质提取物来研究外来体纯化方案（Domanski等， / ...
|
|
|
| Polysome Fractionation to Analyze mRNA Distribution Profiles
|
|
Author:
Date:
2017-02-05
[Abstract] Eukaryotic cells adapt to changes in external or internal signals by precisely modulating the expression of specific gene products. The expression of protein-coding genes is controlled at the transcriptional and post-transcriptional levels. Among the latter steps, the regulation of translation is particularly important in cellular processes that require rapid changes in protein expression patterns. The translational efficiency of mRNAs is altered by RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding (nc)RNAs such as microRNAs (Panda et al., 2014a and 2014b; Abdelmohsen et al., 2014). ...
[摘要] 真核细胞通过精确调节特定基因产物的表达来适应外部或内部信号的变化。蛋白质编码基因的表达受到转录和转录后水平的控制。在后面的步骤中，翻译的调节在需要蛋白质表达模式快速变化的细胞过程中特别重要。 mRNA的翻译效率由RNA结合蛋白（RBP）和非编码（nc）RNA如微RNA（Panda等人，2014a和2014b; Abdelmohsen等人）改变2014）。调节选择性mRNA翻译的因素的影响是RNA生物学中的一个关键问题。多核糖体（多核糖体）分馏分析是评估核糖体与给定mRNA的关联的有效方法。它提供了关于该mRNA的翻译状态的有价值的信息，这取决于与它们相关联的核糖体的数目，并且鉴定未翻译的mRNA（Panda等人，2016）。与许多核糖体相关的mRNA形成大量的多核糖体，预计将被主动翻译，而与少数或没有核糖体相关的mRNA有可能翻译不佳。总之，多聚糖分馏分析允许直接测定整个转录组水平的翻译效率以及个体mRNA。
背景 ...
|
|
|
| Infection of Nicotiana benthamiana Plants with Potato Virus X (PVX)
|
|
Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Potato Virus X (PVX) is the type member of Potexvirus genus, a group of plant viruses with a positive-strand RNA genome (~6.4 kb). PVX is able to establish compatible infections in Nicotiana benthamiana, a commonly used host in plant virology, leading to mild symptoms, such as chlorotic mosaic and mottling. PVX has been widely used as a viral vector for more than two decades (Chapman et al., 1992; Baulcombe et al., 1995; Aguilar et al., 2015). It provides a feasible means for the systemic expression in plants of heterologous proteins, such ...
[摘要] 马铃薯病毒X（PVX）是Potexvirus属（一组具有正链RNA基因组（〜6.4kb）的植物病毒）的类型成员。 PVX能够在烟草烟草（Nicotiana benthamiana）中建立相容的感染，这是常用于植物病毒学的宿主，导致轻度症状，如褪色马赛克和斑驳。 PVX已经被广泛用作病毒载体二十多年（Chapman等人，1992; Baulcombe等人，1995; Aguilar等人。它为异源蛋白质植物中的全身表达提供了可行的手段，例如无毒性因子，具有药理学性质的蛋白质，等等（Hammond-Kosack等人， 1995; Gleba等人，2014），并且还作为通过病毒诱导的基因沉默（VACS）（Lacomme和Chapman，2008）帮助解释植物中基因功能的工具。摩擦（A）和农用过滤（B）的两种不同的方案，即允许PVX在N中的有效乘法和传播。本文详细描述本文。摩擦方法需要先前感染的液体，并且通过诱导对叶组织的机械损伤来实现感染，从而允许病毒颗粒穿透植物表面。农杆菌过滤需要先前修饰的农杆菌携带并将PVX序列递送到植物细胞中。将土壤杆菌生长直至饱和，并用注射器将其浸入植物组织中建立感染。这两种方法中的任何一种都可以成功应用，选择应主要基于材料和时间的可用性，但建议在使用嵌合病毒时使用农杆菌滤过。
背景 ...
|
|
|