| Using Stable Isotopes in Bone Marrow Derived Macrophage to Analyze Metabolism
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Using gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) to analyze the citric acid cycle (CAC) and related intermediates (such as glutamate, glutamine, GABA, and aspartate) is an analytical approach to identify unexpected correlations between apparently related and unrelated pathways of energy metabolism. Intermediates can be as expressed as their absolute concentrations or relative ratios by using known amounts of added reference standards to the sample. GC-MS can also distinguish between heavy labeled molecules (2H- or 13C-labeled) and the naturally occurring most abundant ...
[摘要] 使用气相色谱质谱（GC-MS）分析柠檬酸循环（CAC）和相关中间体（如谷氨酸，谷氨酰胺，GABA和天冬氨酸）是一种分析方法，用于识别明显相关和不相关的能量途径之间的意外相关性代谢。通过使用已知量的样品添加的参考标准，中间体可以表示为它们的绝对浓度或相对比例。 GC-MS还可以区分重标记分子（ 2 H-或 13 C-标记的）和天然存在的最丰富的分子。使用示踪剂的应用还可以评估在各种生理和病理条件下以及用于途径发现的特定代谢池的周转。
以下方案是一种相对简单的方法，不仅对小浓度的代谢中间体敏感，而且还可以 in vivo 或 in vitro 用于确定各种新陈代谢的完整性途径，如特定代谢物池内的通量变化。我们使用该协议来确定磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1 （ Pck1 ）基因在小鼠巨噬细胞中的作用，以确定 13 C将葡萄糖标记为特定的CAC代谢物库
【背景】随着细胞和小鼠中基因表达改变的发展，需要了解这些缺失或过表达的基因如何影响代谢途径的调节。在该方案中，我们使用稳定同位素来确定进入CAC的葡萄糖通量如何改变葡萄糖对柠檬酸盐，琥珀酸盐和苹果酸盐的贡献。使用稳定同位素和目标分析代谢只是在细胞培养中使用稳定同位素的一个好处。
本方案中描述的用于细胞内代谢物功能定量的方法是通过在U- 13 ...
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| Lentiviral Knockdown of Transcription Factor STAT1 in Peromyscus leucopus to Assess Its Role in the Restriction of Tick-borne Flaviviruses
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Cellular infection with tick-borne flaviviruses (TBFVs) results in activation of the interferon (IFN) signaling pathway and subsequent upregulation of numerous genes termed IFN stimulated genes (ISGs) (Schoggins et al., 2011). Many ISGs function to prevent virus pathogenesis by acting in a broad or specific manner through protein-protein interactions (Duggal and Emerman, 2012). The potency of the IFN signaling response determines the outcome of TBFV infection (Best, 2017; Carletti et al., 2017). Interestingly, data from our lab show that TBFV replication is significantly ...
[摘要] 蜱传黄热病病毒（TBFV）的细胞感染导致干扰素（IFN）信号传导途径的激活和随后称为IFN刺激基因（ISG）（Schoggins等人，2011）的众多基因的上调。许多ISG通过蛋白质 - 蛋白质相互作用以广泛或特定的方式起作用来防止病毒发病（Duggal和Emerman，2012）。 IFN信号反应的效力决定了TBFV感染的结果（Best，2016; Carletti等人，2017）。有趣的是，我们实验室的数据显示TBFV复制在储库物种Peromyscus leucopus的细胞中显着受到限制，从而表明有效的抗病毒应答（Izuogu等人，2017）。我们评估干扰素信号对抗性的相对贡献。通过敲低IFN反应途径中的主要转录因子来抑制白血病。信号转导和转录激活因子1（STAT1）是专门针对在P。 leucopus细胞通过shRNA技术。我们进一步测试了基因敲低对细胞对IFN反应和限制病毒复制的能力的影响;结果表明当STAT1表达被改变时，leucopus细胞对IFN刺激的反应降低，并且对TBFV复制显着更敏感。
【背景】IFN信号是抵抗侵入宿主细胞的黄病毒的第一道防线（Robertson等人，2009; Lazear和Diamond，2015）。通过模式识别受体（PRR）检测与病毒颗粒相关的分子标记，然后通过转录因子引发下游信号从细胞释放1型IFN（Kawai ...
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| Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC)
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are adult stem cells which have been shown to improve survival, enhance bacterial clearance and alleviate inflammation in pre-clinical models of acute respiratory distress syndrome (ARDS) and sepsis. These diseases are characterised by uncontrolled inflammation often underpinned by bacterial infection. The mechanisms of MSC immunomodulatory effects are not fully understood yet. We sought to investigate MSC cell contact-dependent communication with alveolar macrophages (AM), professional phagocytes which play an important role in the lung inflammatory ...
[摘要] 间充质干/基质细胞（MSC）是成年干细胞，已被证明可以改善急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和败血症临床前模型中的存活，增强细菌清除和减轻炎症。这些疾病的特征在于通常受细菌感染支持的不受控制的炎症。 MSC免疫调节作用的机制尚未完全了解。我们试图研究与肺泡巨噬细胞（AM），在肺炎症反应和抗菌防御中起重要作用的专业吞噬细胞的MSC细胞接触依赖性通信。通过使用基本的直接共培养系统，共聚焦显微镜和流式细胞术，我们通过隧道纳米管（TNT）显现并有效量化了MSC线粒体转移到AM。为了模拟人类AM，在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在下，从人供体血液中分离原代单核细胞并分化成巨噬细胞（单核细胞衍生的巨噬细胞，MDM），从而允许适应AM样表型（de Almeida等人，2000; Guilliams等人，2013）。人骨髓衍生的MSC用线粒体特异性荧光染色标记，广泛洗涤，以1:20（MSC / ...
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