| Reconstitution of Chromatin by Stepwise Salt Dialysis
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] Chromatin, rather than plain DNA, is the natural substrate of the molecular machines that mediate DNA-directed processes in the nucleus. Chromatin can be reconstituted in vitro by using different methodologies. The salt dialysis method yields chromatin that consists of purified histones and DNA. This biochemically pure chromatin is well-suited for a wide range of applications. Here, we describe simple and straightforward protocols for the reconstitution of chromatin by stepwise salt dialysis and the analysis of the chromatin by the micrococcal nuclease (MNase) digestion assay. Chromatin that ...
[摘要] [摘要]染色质而不是普通的DNA是介导细胞核中DNA定向过程的分子机器的天然底物。染色质可以重新构建d体外b ÿ使用不同的方法。盐渗析法产生的染色质由纯化的组蛋白和DNA组成。这种生物化学纯的染色质非常适合广泛的应用。在这里，我们描述了通过逐步盐透析和通过微球菌核酸酶（MNase）消化测定法对染色质进行分析的染色质重构的简单明了的协议。该复原用该方法染色质，可用于高效同源定向修复（HDR）介导的基因编辑编 使用CRISPR-Cas9系统，以及用于染色质动力学和功能的生化研究。
[背景]真核细胞中的DNA被组织成染色质。因此，理想情况下，DNA定向过程的分析（例如复制，重组，修复和转录）将使用染色质模板而不是纯DNA进行（Kadonaga，2019）。为此，染色质可通过使用ATP依赖性或ATP依赖性方法在体外从纯化的成分中重建（有关综述，请参见Lusser和Kadonaga，2004年）。
在这里，我们描述了染色质重建的特定方法，该方法在我们利用CRISPR-Cas9系统对细胞进行HDR介导的基因编辑研究中采用了（Cruz-Becerra和Kadonaga，2020年）。在这项工作中，我们发现相对于普通的（裸）DNA供体模板，通过使用染色质供体模板可以增强精确的HDR介导的DNA插入。我们还将这种方法用于染色质的生化分析，包括高迁移性N组（HMGN）蛋白（Rattner等，2009），染色质动力学（Torigoe等，2013），前核小体（Fei）的表征。等人，2015年），以及核小体失稳因子（NDF）（F ...
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| In vitro Measurement of CMP-Sialic Acid Transporter Activity in Reconstituted Proteoliposomes
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Author:
Date:
2020-03-20
[Abstract] Nucleotide-sugar transporters (NSTs) facilitate eukaryotic cellular glycosylation by transporting nucleotide-sugar conjugates into the Golgi lumen and endoplasmic reticulum for use by glycosyltransferases, while also transferring nucleotide monophosphate byproducts to the cytoplasm. Mutations in this family of proteins can cause a number of significant cellular pathologies, and wild type members can act as virulence factors for many parasites and fungi. Here, we describe an in vitro assay to measure the transport activity of the CMP-sialic acid transporter (CST), one of seven NSTs ...
[摘要] [ 摘要] 核苷酸糖转运蛋白（NST）通过将核苷酸糖结合物转运到高尔基腔和内质网供糖基转移酶使用，同时将核苷酸单磷酸副产物转移到细胞质中，从而促进了真核细胞的糖基化。该蛋白质家族的突变可引起许多重要的细胞病理，野生型成员可充当许多寄生虫和真菌的致病因子。在这里，我们描述了一种体外测定法，以测量CMP-唾液酸转运蛋白（CST）的转运活性，CMP-唾液酸转运蛋白（CST）是在哺乳动物中发现的七个NST之一。虽然在体外 以前已经针对CST进行了转运分析，但这些研究未能说明以下事实：1 ）CMP- 唾液酸（CMP-Sia ）的商业库存由约10％的高亲和力CMP组成，以及2）CMP- SIA 是水解d 到CMP和在水溶液中的唾液酸。在这里，我们描述了一种用非选择性磷酸酶南极磷酸酶治疗CMP-Sia的方法，以将所有游离CMP转化为胞苷。这使我们能够准确地测量重组为蛋白脂质体的纯化CST的底物亲和力和运输动力学。
[ 背景技术]一旦在细胞质或细胞核合成，核苷酸偶联的糖被输送到内质网的内腔（ER）由核苷酸-糖转运蛋白（NSTS）或高尔基体（青木等人，2003）。在这些亚细胞区室中，糖基转移酶利用糖部分糖基化脂质和蛋白质，产生副产物核苷酸单磷酸酯（NMP）（Capasso和Hirschberg，1984 ；Milla和Hirschberg ，1989； ...
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| Combinations of Patch-Clamp and Confocal Calcium Imaging in Acutely Isolated Adult Mouse Amygdala Brain Slices
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2018-08-05
[Abstract] Calcium imaging is a powerful technique in the study of neuronal physiology, as it avoids the enzyme treatment on neurons and is able to study the neuronal activities in vivo. Using calcium-imaging techniques, we are able to monitor the elevation of calcium in the neuron. Furthermore, we can combine calcium imaging with other methods, like whole-cell patch clamp recordings, to detect a single cell calcium signal in brain slices. In this protocol, we describe a detailed confocal imaging method that is combined with whole-cell patch clamp configuration using brain slices (Du et al. ...
[摘要] 钙成像是神经生理学研究中的一项强有力的技术，因为它避免了对神经元的酶处理，并且能够研究体内的神经元活动。 使用钙成像技术，我们能够监测神经元中钙的升高。 此外，我们可以将钙成像与其他方法结合起来，如全细胞膜片钳记录，以检测脑切片中的单细胞钙信号。 在该协议中，我们描述了一种详细的共焦成像方法，该方法与使用脑切片的全细胞膜片钳配置相结合（Du et al。，2017）。
【背景】几十年来，脑切片已成功用于研究突触，神经元和神经回路。许多实验操作已经应用于脑切片模型，例如药物应用，细胞内记录和光学成像。与培养的神经元相比，脑切片保留了神经元回路的许多基本功能特性。钙成像是一种广泛使用的技术，旨在表明分离的细胞和组织的细胞内钙（Ca 2 + ）状态。研究脑组织中的细胞内钙可以深入了解各种生理过程，如细胞增殖，信号转导，突触可塑性和细胞死亡，因为钙浓度在这些功能中起着关键作用（Cameron et al。，2016）。钙指示剂是一种荧光分子，它与Ca 2 + ...
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