An in vitro Co-culture System for the Activation of CD40 by Membrane-presented CD40 Ligand versus Soluble Agonist
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] One fundamental property of the TNR receptor (TNFR) family relates to how ‘signal quality’ (the extent of receptor ligation or cross-linking) influences the outcome of receptor ligation, for instance the induction of death in tumour cells. It is unequivocal that membrane-presented ligand (delivered to target cells via cell-surface presentation by co-culture with ligand-expressing third-party cells) induces a greater extent of carcinoma cell death in vitro in comparison to non-cross-linked agonists (agonistic antibodies and/or recombinant ligands). The CD40 receptor epitomises this ...
[摘要] TNR受体(TNFR)家族的一个基本特性涉及“信号质量”(受体连接或交联的程度)如何影响受体连接的结果,例如肿瘤细胞中的死亡诱导。毫无疑问,膜呈递配体(通过与表达配体的第三方细胞共培养通过细胞表面呈递递送至靶细胞)在体外诱导更大程度的癌细胞死亡非交联激动剂(激动性抗体和/或重组配体)。 CD40受体集中体现了TNF受体 - 配体相互作用的这种基本特性,因为CD40交联的程度决定了细胞命运。膜呈递CD40配体(mCD40L),但不是可溶性激动剂(例如,激动性抗CD40抗体),诱导高水平的促炎细胞因子分泌并导致恶性肿瘤细胞广泛死亡(细胞凋亡)但不是正常的)上皮细胞。在本文中,我们描述了通过mCD40L激活CD40并随后检测细胞凋亡的各种特征(包括细胞膜透化,DNA片段化,半胱天冬酶活化)以及细胞内细胞死亡介质检测的共培养系统(包括衔接蛋白,促凋亡激酶和活性氧,ROS)。
【背景】TNFR及其配体在调节淋巴组织以及上皮(尤其是癌)细胞中的细胞增殖或死亡中的作用已经在广泛研究中,因为它们诱导细胞死亡(主要通过细胞凋亡)的能力代表了有希望的目标。用于癌症治疗。然而,重要的是,当以可溶性对膜结合形式存在时,TNFR激动剂引发细胞死亡的能力存在明显差异。当作为单独治疗施用时,可溶性激动剂通常表现出相对低的细胞毒性效力,而膜呈递的配体似乎是优越的(Albarbar ...
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Mating Based Split-ubiquitin Assay for Detection of Protein Interactions
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Date:
2017-05-05
[Abstract] The mating based split-ubiquitin (mbSUS) assay is an alternative method to the classical yeast two-hybrid system with a number of advantages. The mbSUS assay relies on the ubiquitin-degradation pathway as a sensor for protein-protein interactions, and it is suitable for the determination of interactions between full-length proteins that are cytosolic or membrane-bound. Here we describe the mbSUS assay protocol which has been used for detecting the interaction between K+ channel and SNARE proteins (Grefen et al., 2010 and 2015; Zhang et al., 2015 and 2016)
[摘要] 基于交配的分ubiquitin(mbSUS)测定是具有许多优点的经典酵母双杂交系统的替代方法。 mbSUS测定依赖于泛素降解途径作为蛋白质 - 蛋白质相互作用的传感器,并且它适用于测定细胞溶质或膜结合的全长蛋白质之间的相互作用。在这里,我们描述了已经用于检测K + 通道和SNARE蛋白之间的相互作用的mbSUS测定方案(Grefen等人,2010和2015; Zhang 等等,2015和2016)
背景 图1是mbSUS测定的概况。泛素部分被分成两半,N末端半突变(NubG)以避免重组。泛素部分(Cub)的C末端一半与转录报告基因复合物PLV(Protein A-LexA-VP16)连接。两种蛋白质(X和Y)分别与NubG和CubPLV融合产生蛋白质 - 蛋白质相互作用分析系统。转化后,酵母菌株THY.AP5含有NubG-X融合蛋白,而酵母菌株THY.AP4含有Y-CubPLV融合蛋白。在交配后,在二倍体酵母中,如果蛋白质X和Y彼此相互作用,则将重新组装功能性泛素,这导致PLV的切割。释放的转录蛋白复合物PLV可以开启报告基因(ADE2,HIS3),并允许酵母生长在选择性培养基上。
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