| Imaging Microtubules in vitro at High Resolution while Preserving their Structure
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] Microtubules (MT) are the most rigid component of the cytoskeleton. Nevertheless, they often appear highly curved in the cellular context and the mechanisms governing their overall shape are poorly understood. Currently, in vitro microtubule analysis relies primarily on electron microscopy for its high resolution and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy for its ability to image live fluorescently-labelled microtubules and associated proteins. For three-dimensional analyses of microtubules with micrometer curvatures, we have developed an assay in which MTs are polymerized ...
[摘要] [摘要]微管（MT）是细胞骨架中最刚性的组成部分。然而，它们在细胞环境中经常显得高度弯曲，并且控制它们整体形状的机理了解甚少。当前，体外微管分析主要依靠电子显微镜进行高分辨率分析，而全内反射荧光（TIRF ）显微镜则可以对活的荧光标记的微管和相关蛋白进行成像。为了对具有微米曲率的微管进行三维分析，我们开发了一种在体外聚合MT的检测方法 用类似于常规TIRF显微镜操作规程的方式将MT种子的MT粘附到载玻片上。除去游离的荧光分子，并通过灌注固定MTs。然后可以使用带有Airyscan模块的共聚焦显微镜观察MT，以获得更高的分辨率。该协议允许对保留其原始三维形状并与高分辨率免疫荧光检测兼容的微管进行成像。
[背景]微管（MT）是通过异源二聚体的组合制成的聚合物α和β微管蛋白，并且是细胞骨架的主要成分。他们参与了细胞功能的基本机制，如有丝分裂，细胞内转运，胞质分裂和细胞形态的维持（Akhmanova和Steinmetz，2015）。尽管MT本身具有很高的刚性，但它们通常会在细胞中弯曲并产生一些蛋白，从而弯曲微管（Brangwynne等人，2006; Bechstedt等人，2014; Leung等人，2020; Cuveillier等人，2020 ...
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| Observing Nutrient Gradients, Gene Expression and Growth Variation Using the "Yeast Machine" Microfluidic Device
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] The natural environment of microbial cells like bacteria and yeast is often a complex community in which growth and internal organization reflect morphogenetic processes and interactions that are dependent on spatial position and time. While most of research is performed in simple homogeneous environments (e.g., bulk liquid cultures), which cannot capture full spatiotemporal community dynamics, studying biofilms or colonies is complex and usually does not give access to the spatiotemporal dynamics at single cell level. Here, we detail a protocol for generation of a microfluidic ...
[摘要] [摘要 ] 微生物细胞（如细菌和酵母菌）的自然环境通常是一个复杂的社区，在该社区中，生长和内部组织反映了形态发生过程和相互作用，这些过程和相互作用取决于空间位置和时间。虽然大多数研究是在无法捕获完整时空群落动态的简单同质环境（例如，大量液体培养）中进行的，但研究生物膜或菌落却很复杂，通常无法在单个细胞水平上获得时空动态。在这里，我们详细介绍了一种用于生成微流控设备（“酵母机器”）的协议，该协议带有酵母菌落的长单层阵列，以推进对细胞间代谢相互作用如何影响已定义和可定制的空间尺寸内菌落内部结构的全球了解。以酿酒酵母作为模型酵母系统，我们使用“酵母机器”通过追踪荧光标记的己糖转运蛋白来证明葡萄糖梯度的出现。我们进一步量化了菌落内生长速率的表达空间模式和葡萄糖可利用性调控的其他基因的表达。除此之外，我们显示出氨基酸的梯度也在菌落内形成，潜在地打开了类似的方法来研究许多其他营养物和代谢废物的梯度的时空形成。该方法将来可用于在与生态学和进化有关的单细胞分辨率和时标下，破译其他相同物种或更复杂的多物种系统中的远程代谢相互作用，细胞发育和形态发生之间的相互作用。
[背景 ] ...
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| Immunostaining of Formaldehyde-fixed Metaphase Chromosome from Untreated and Aphidicolin-treated DT40 Cells
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Date:
2017-05-05
[Abstract] During mitosis chromosomes are condensed into dense X-shaped structures that allow for microscopic determination of karyotype as well as inspection of chromosome morphology.
This protocol describes a method to perform immunostaining of formaldehyde-fixed metaphase chromosomes from the avian cell line DT40. It was developed to characterize the localization of YFP-tagged TopBP1 on mitotic chromosomes and specifically determine the percentage of TopBP1 foci that formed on breaks/gaps as well as ends of individual metaphase macrochromosomes (Pedersen et al., 2015). For this ...
[摘要] 在有丝分裂期间，染色体被浓缩成致密X型结构，允许显微检测染色体核型和检查染色体形态。
该方案描述了从禽细胞系DT40进行甲醛固定的中期染色体的免疫染色的方法。 它被开发用于表征YFP标记的TopBP1在有丝分裂染色体上的定位，并且具体确定形成于断裂/间隙以及单个中期大染色体末端的TopBP1灶的百分比（Pedersen等，2015）。 为此，应用YFP的免疫染色。 然而，该协议可以针对其他细胞系或表位进行优化。
【背景】染色中期染色体的显微镜分析是经典的细胞遗传学技术，广泛用于研究和诊断。基本原理包括通过锭子不稳定试剂如谷氨酸诱导中期细胞周期停滞，这将触发主轴装配检查点，从而阻止细胞在中期。这用于富集浓缩染色体的细胞。随后将细胞在低渗溶液中进行溶胀，然后在显微镜载玻片上铺展有丝分裂细胞。最终结果是来自单细胞的显微镜检测染色体，便于染色体核型分析以及个体染色体的研究。传统上，肿胀的细胞用甲醇和乙酸（3:1）固定，然后铺展在载玻片上（Hungerford，1965; Ronne等，1979）。
这里描述的方法使用甲醛而不是甲醇进行固定。这可以用于随后用与甲醇固定不相容的抗体染色。该方案针对鸡DT40细胞的中期传播进行了优化，YFP标记的TopBP1在中期大染色体上的免疫染色（Pedersen等，2015）。 ...
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