| Dual sgRNA-based Targeted Deletion of Large Genomic Regions and Isolation of Heritable Cas9-free Mutants in Arabidopsis
|
|
Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] CRISPR/Cas9 system directed by a gene-specific single guide RNA (sgRNA) is an effective tool for genome editing such as deletions of few bases in coding genes. However, targeted deletion of larger regions generate loss-of-function alleles that offer a straightforward starting point for functional dissections of genomic loci. We present an easy-to-use strategy including a fast cloning dual-sgRNA vector linked to efficient isolation of heritable Cas9-free genomic deletions to rapidly and cost-effectively generate a targeted heritable genome deletion. This step-by-step protocol ...
[摘要] [摘要] CRISPR/Cas9由基因特异性单导RNA（sgRNA）引导的系统是一种有效的基因组编辑工具，如编码基因中少部分碱基的删除。然而，大区域的靶向缺失产生功能缺失等位基因，这为基因组基因座的功能解剖提供了一个直接的起点。我们提出了一个简单易用的策略，包括一个快速克隆双sgRNA载体，有效分离可遗传的Cas9游离基因组缺失，以快速且经济有效地产生靶向遗传基因组缺失。该方法包括拟南芥的gRNA设计、克隆策略和突变检测，可适用于其他植物。
[背景] ...
|
|
|
| Fluorescently Labelled Aerolysin (FLAER) Labelling of Candida albicans Cells
|
|
Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] In this protocol we describe a nonradiolabelled labelling of GPI anchor in Candida albicans. The method uses a fluorescent probe to bind specifically to GPI anchors so that the level of GPI-anchored proteins at the cell surface can be measured. The labelling does not need permeabilization of cells and can be carried out in vivo.
[摘要] 在本协议中，我们描述了白色念珠菌中GPI锚的非放射性标记标记。该方法使用荧光探针特异性结合GPI锚点，从而可以测量细胞表面的GPI锚定蛋白的水平。标记不需要细胞的透化，并且可以在体内进行进行。
背景 GPI（糖基磷脂酰肌醇）锚是在内质网（ER）中发生的翻译后修饰。预先形成的GPI锚定体连接到携带GPI锚定附着信号序列的特异性蛋白质的C末端的ER的内腔中。这些蛋白质随后通过分泌途径转移（并进一步修饰）到细胞表面，其中蛋白质锚定在质膜的细胞外小叶上或共价连接到具有壁的生物中的细胞壁。各种蛋白质在真核生物中获得GPI锚定蛋白，例如水解酶，细胞表面粘附分子或受体蛋白（Orlean和Menon，2007）。在真菌病原体中，例如白色念珠菌，参与宿主识别和粘附的许多粘附素以及几种发病机理和毒力因子是GPI锚定蛋白;此外，白色念珠菌中的几种GPI锚定蛋白具有蛋白水解活性（Richard和Plaine，2007; Nobile等人，2008）。该途径在白色念珠菌中是必不可少的，并且其下调或靶向它可能是打击念珠菌感染的有用策略。本文详细阐述了用于评估白色念珠菌中GPI锚定水平的方案。
＆NBSP;荧光标记的Aerolysin（FLAER）是荧光素标记的非溶性细胞溶解素的无活性衍生物，革兰氏阴性细菌毒素，其与真核宿主的细胞膜中的GPI锚定的蛋白质结合并形成孔（Howard等， ...
|
|
|
| Explant Methodology for Analyzing Neuroblast Migration
|
|
Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] The subventricular zone (SVZ) in the mammalian forebrain contains stem/progenitor cells that migrate through the rostral migratory stream (RMS) to the olfactory bulb throughout adulthood. SVZ-derived explant cultures provide a convenient method to assess factors regulating the intermediary stage of neural stem/progenitor cell migration. Here, we describe the isolation of SVZ-derived RMS explants from the neonatal mouse brain, and the conditions required to culture and evaluate their migration.
[摘要] 哺乳动物前脑中的室下区（SVZ）含有在整个成年期间通过流行性流（RMS）迁移到嗅球的茎/祖细胞。 SVZ衍生的外植体培养提供了一种方便的方法来评估调节神经干/祖细胞迁移的中间阶段的因素。在这里，我们描述了SVZ衍生的RMS外植体从新生儿小鼠脑中的分离以及培养和评估其迁移所需的条件。
背景 成年哺乳动物前脑含有一个位于啮齿动物和人类侧脑室旁边的神经源性小生境，并被恰当地命名为室下区（SVZ）。在啮齿动物中，SVZ是细胞的薄的“楔形”，覆盖了侧脑室的整个壁（Mirzadeh等人，2010; Paez-Gonzalez等人。 ，2014; Dixon等人，2016）。在SVZ内，慢分化的星形胶质细胞样B细胞分化成快速分裂的C型神经祖细胞（也称为转运扩增细胞），其产生双皮层蛋白阳性的A型神经母细胞，尽管少突胶质细胞和星形胶质细胞也能够（Garcia-Verdugo等人，1998; Tavazoie等人，2008; Rikani等人，2013）。在啮齿动物中，每天估计有10,000到30,000个神经母细胞。这些成神经细胞在通过流行流体流（RMS）迁移到嗅球时形成链（Lois和Alvarez-Buylla，1994; ...
|
|
|