| Heterologous Expression and Purification of the CRISPR-Cas12a/Cpf1 Protein
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions (Figure 1) for heterologous expression of Francisella novicida Cas12a (previously known as Cpf1) in Escherichia coli. It additionally includes a protocol for high-purity purification and briefly describes how activity assays can be performed. These protocols can also be used for purification of other Cas12a homologs and the purified proteins can be used for subsequent genome editing experiments.
Figure 1. Timeline of activities for the ...
[摘要] 该协议提供了分步说明（图1），用于在大肠杆菌中异源表达新西兰弗朗西斯菌弗朗西丝菌Cas12a（以前称为Cpf1）。 它还包括一个高纯度纯化方案，并简要介绍如何进行活性测定。 这些方案也可以用于其他Cas12a同系物的纯化，并且纯化的蛋白质可以用于随后的基因组编辑实验。
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图1.从大肠杆菌 异源表达和纯化<弗朗西斯弗朗西丝菌 Cas12a（FnCas12a）的活动时间表
【背景】原核CRISPR-Cas免疫系统通过使用CRISPR RNA（crRNA）作为外源DNA或RNA的序列特异性靶向的指导来提供针对病毒和质粒的保护（van der Oost等人，2014; Marraffini ，2015）。 1类CRISPR-Cas系统（包含I型，III型和IV型）通常形成多亚基蛋白-cRNA效应复合物，而2类系统（包含II型，V型和VI型）依赖于单个crRNA-引导的效应物核酸酶用于目标干扰（Mohanraju et al。 2016年）。
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| Selection of Genetically Modified Bacteriophages Using the CRISPR-Cas System
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] We present a CRISPR-Cas based technique for deleting genes from the T7 bacteriophage genome. A DNA fragment encoding homologous arms to the target gene to be deleted is first cloned into a plasmid. The T7 phage is then propagated in Escherichia coli harboring this plasmid. During this propagation, some phage genomes undergo homologous recombination with the plasmid, thus deleting the targeted gene. To select for these genomes, the CRISPR-Cas system is used to cleave non-edited genomes, enabling isolation of the desired recombinant phages. This protocol allows seamless deletion of ...
[摘要] 我们提出了一种用于从T7噬菌体基因组中删除基因的基于CRISPR-Cas的技术。 首先将编码与待缺失的靶基因的同源臂的DNA片段克隆到质粒中。 然后将T7噬菌体在携带该质粒的大肠杆菌中繁殖。 在这种繁殖期间，一些噬菌体基因组与质粒进行同源重组，从而缺失靶基因。 为了选择这些基因组，CRISPR-Cas系统用于切割未编辑的基因组，从而能够分离所需的重组噬菌体。 该协议允许在T7噬菌体中无缝地删除所需的基因，并且可以扩展到其它噬菌体和其他类型的遗传操作。
【背景】噬菌体（噬菌体）是生物圈中最普遍和广泛分布的生物实体，突出了它们的生态重要性（Suttle，2007）。许多研究还提出将噬菌体用于医疗目的（Weber-Dabrowska等人，2001; Merril等人，2003; Harper和Enright，2011; Edgar ，2012; Bikard等人，2014; Citorik等人，2014; Yosef等人， 2014年和2015年）。不幸的是，仅有少数公开的方法详细描述了噬菌体基因组学的基因工程（Selick等人，1988; Marinelli等人，2008; ...
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| Conjugation Assay for Testing CRISPR-Cas Anti-plasmid Immunity in Staphylococci
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] CRISPR-Cas is a prokaryotic adaptive immune system that prevents uptake of mobile genetic elements such as bacteriophages and plasmids. Plasmid transfer between bacteria is of particular clinical concern due to increasing amounts of antibiotic resistant pathogens found in humans as a result of transfer of resistance plasmids within and between species. Testing the ability of CRISPR-Cas systems to block plasmid transfer in various conditions or with CRISPR-Cas mutants provides key insights into the functionality and mechanisms of CRISPR-Cas as well as how antibiotic resistance spreads within ...
[摘要] CRISPR-Cas是一种原核适应性免疫系统，可防止移植遗传因子如噬菌体和质粒的摄取。细菌之间的质粒转移是特别临床关注的，因为由于在物种内和物种之间转移抗性质粒而在人体中发现的抗生素抗性病原体的量增加。测试CRISPR-Cas系统在各种条件下或使用CRISPR-Cas突变体阻断质粒转移的能力，为CRISPR-Cas的功能和机制以及抗菌素抗性如何在细菌群落中传播提供了重要的见解。在这里，我们描述了一种量化CRISPR-Cas对通过共轭进行质粒转移效率的影响的方法。虽然这种方法在葡萄球菌属物种中呈现，但它可以更广泛地用于任何共轭原核生物。
背景 CRISPR-Cas（聚集的，定期间隔的，短的回文重复CRISPR相关联）是几乎90％的测序古菌和约40％的细菌中发现的原核适应性免疫系统（Makarova等人，2015） ）。这些系统以序列特异性方式识别和破坏核酸侵入体（van der Oost等人，2014）。 CRISPR基因座通常包含短的DNA重复序列（长度为约35个核苷酸），其通过称为间隔区的等短的唯一序列分开，其通常来自移动遗传元件。重复序列和间隔区被转录并处理成小的CRISPR RNA（crRNA），每个指定单个靶标。 ...
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