| Purification of Globular Actin from Rabbit Muscle and Pyrene Fluorescent Assays to Investigate Actin Dynamics in vitro
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Author:
Date:
2018-12-05
[Abstract] Pyrene Fluorescent Assay is established to monitor the dynamic actin nucleation, elongation, capping and disassembly in vitro. This technique provides an easy handle procedure and straightforward visual data analysis. By coupling actin purification and polymerization assays in this protocol, the readers could quickly get the affordable and straightforward assays to study actin dynamics.
[摘要] 建立芘荧光测定法以监测动态肌动蛋白成核，伸长，加帽和体外拆解>。 该技术提供了简单的处理程序和直观的可视化数据分析。 通过在该方案中偶联肌动蛋白纯化和聚合测定，读者可以快速获得用于研究肌动蛋白动力学的经济且直接的测定。
【背景】肌动蛋白动力学在细胞生物学功能的关键方面起着重要作用，例如细胞运动，内体运输，支架和对外部刺激的反应（Pollard和Cooper，2009; Weinberg和Drubin，2012; Sun et al。 >，2018）。肌动蛋白细胞骨架的重排包括成核，伸长，稳定化，加帽，交联和解聚，受肌动蛋白结合蛋白（ABP）的严格控制（Pollard，2016）。 肌动蛋白调节中这些ABP的生化功能的体外>研究为理解肌动蛋白网络调节的机制提供了见解。在这里，我们提供了一个易于理解的协议，可用于肌动蛋白细胞骨架相关的生物化学实验，包括肌动蛋白纯化，芘肌动蛋白测定。该方案提供了用其他肌动蛋白结合蛋白体外监测肌动蛋白装配的方法，并帮助研究人员了解不同条件下的肌动蛋白动力学过程。该协议为用户提供了清晰的表格模板以制备反应混合物。简化了复杂的计算步骤。该协议使用高通量多孔方法代替比色皿测量，以提供更高的通量和样品之间的良好平行比较。
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| A Highly Sensitive Anion Exchange Chromatography Method for Measuring cGAS Activity in vitro
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] Cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) is a pattern recognition receptor (PRR) that senses double stranded DNA (dsDNA) in the cytosol and this leads to the activation of stimulator of interferon genes (STING) via the secondary messenger 2’3’-cyclic GMP-AMP (2’3’-cGAMP). STING then recruits TANK binding kinase 1 (TBK-1) and this complex can phosphorylate and activate interferon regulatory factor 3 (IRF3) leading to the induction of type I interferons and other antiviral genes. The cGAS:DNA complex catalyzes the synthesis of 2’3’-cGAMP and the purpose of the protocol presented here is to measure the in ...
[摘要] 环状GMP-AMP合酶（cGAS）是一种模式识别受体（PRR），可以感知胞质溶胶中的双链DNA（dsDNA），并通过第二信使2'3'来激活干扰素基因刺激物（STING）。环GMP-AMP（2'3'-cGAMP）。然后STING募集TANK结合激酶1（TBK-1），该复合物可磷酸化并激活干扰素调节因子3（IRF3），导致I型干扰素和其他抗病毒基因的诱导。 cGAS：DNA复合物催化2'3'-cGAMP的合成，这里提出的方案的目的是测量在dsDNA存在下纯化的cGAS的体外>活性。开发该方案是为了阐明dsDNA长度与cGAS活性水平之间的关系。该方法涉及与低浓度cGAS和dsDNA的体外>反应，然后使用阴离子交换色谱法定量反应产物。当比较不同DNA片段激活cGAS的能力时，低浓度的cGAS和dsDNA以及该测定的高灵敏度是关键优势。
【背景】细胞胞质内存在双链DNA是DNA或逆转录病毒感染的潜在迹象。核苷酸转移酶cGAS作为感知细胞溶质dsDNA的模式识别受体起作用。 cGAS被dsDNA变构激活并催化ATP和GTP转化为环状二核苷酸2'3'-cGAMP（或简称cGAMP）（Ablasser et al。>，2013; Civril et al 。>，2013; Diner et al。>，2013; Gao et al。>，2013; ...
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| Heterologous Expression and Purification of the CRISPR-Cas12a/Cpf1 Protein
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions (Figure 1) for heterologous expression of Francisella novicida Cas12a (previously known as Cpf1) in Escherichia coli. It additionally includes a protocol for high-purity purification and briefly describes how activity assays can be performed. These protocols can also be used for purification of other Cas12a homologs and the purified proteins can be used for subsequent genome editing experiments.
Figure 1. Timeline of activities for the ...
[摘要] 该协议提供了分步说明（图1），用于在大肠杆菌中异源表达新西兰弗朗西斯菌弗朗西丝菌Cas12a（以前称为Cpf1）。 它还包括一个高纯度纯化方案，并简要介绍如何进行活性测定。 这些方案也可以用于其他Cas12a同系物的纯化，并且纯化的蛋白质可以用于随后的基因组编辑实验。
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图1.从大肠杆菌 异源表达和纯化<弗朗西斯弗朗西丝菌 Cas12a（FnCas12a）的活动时间表
【背景】原核CRISPR-Cas免疫系统通过使用CRISPR RNA（crRNA）作为外源DNA或RNA的序列特异性靶向的指导来提供针对病毒和质粒的保护（van der Oost等人，2014; Marraffini ，2015）。 1类CRISPR-Cas系统（包含I型，III型和IV型）通常形成多亚基蛋白-cRNA效应复合物，而2类系统（包含II型，V型和VI型）依赖于单个crRNA-引导的效应物核酸酶用于目标干扰（Mohanraju et al。 2016年）。
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