| Measuring Nucleosome Assembly Activity in vitro with the Nucleosome Assembly and Quantification (NAQ) Assay
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Nucleosomes organize the eukaryotic genome into chromatin. In cells, nucleosome assembly relies on the activity of histone chaperones, proteins with high binding affinity to histones. At least a subset of histone chaperones promotes histone deposition in vivo. However, it has been challenging to characterize this activity, due to the lack of quantitative assays.
Here we developed a quantitative nucleosome assembly (NAQ) assay to measure the amount of nucleosome formation in vitro. This assay relies on a Micrococcal nuclease (MNase) digestion step that yields ...
[摘要] 核小体将真核生物基因组组装成染色质。在细胞中，核小体装配依赖于组蛋白分子伴侣的活性，对组蛋白具有高结合亲和力的蛋白。至少有一部分组蛋白伴侣促进组蛋白在体内的沉积。然而，由于缺乏定量分析，鉴定这种活性一直是一个挑战。
在这里，我们开发了一种定量核小体装配（NAQ）测定来测量体外核小体形成的量。该测定依赖于微球菌核酸酶（MNase）。随后在生物分析仪上运行，可以准确量化相对于加样对照的片段（长度和数量）。这使我们能够测量约150bp的DNA长度。该测定最终实现了不同组蛋白分子伴侣的核小体装配活性的表征，这是理解这些蛋白体内功能作用的一个步骤。
【背景】真核生物基因组被组织成核小体。核小体是由组蛋白八聚体核心组成的模块化和动态结构，由147bp的DNA包裹（Luger等人，1997）。核小体组装始于一个（H3-H4）2四聚体沉积到DNA上以形成四体体。随后的H2A-H2B二聚体结合形成六聚体，最后形成核小体。组蛋白高度带电，因为它们以生理盐浓度存在于组蛋白二聚体中。由于它们的作用，组蛋白需要分子伴侣将它们从细胞质穿梭到细胞核，然后辅助它们沉积到DNA上或从DNA上去除（Gurard-Levin等人，2014）。
组蛋白分子伴侣分组在结构上不相关的蛋白质家族中，所有这些蛋白质的特征在于对组蛋白的高度结合亲和力（Laskey等，1978）。通过这种方式，他们屏蔽了组蛋白的电荷，阻止了与DNA和其他细胞因子的非特异性相互作用（Elsässerand ...
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| Nucleosome Positioning Assay
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] The basic unit of chromatin is the nucleosome, a histone octamer with 147 base pairs of DNA wrapped around it. Positions of nucleosomes relative to each other and to DNA elements have a strong impact on chromatin structure and gene activity and are tightly regulated at multiple levels, i.e., DNA sequence, transcription factor binding, histone modifications and variants, and chromatin remodeling enzymes (Bell et al., 2011; Hughes and Rando, 2014). Nucleosome positions in cells or isolated nuclei can be detected by partial nuclease digestion of native or cross-linked chromatin ...
[摘要] 染色质的基本单位是核小体，一个组织蛋白八聚体，其中包含147个碱基对的DNA。核小体相对于彼此和DNA元件的位置对染色质结构和基因活性具有强烈的影响，并且在多个水平（例如，DNA序列，转录因子结合，组蛋白修饰和变体）和染色质重塑酶（Bell et al。，2011; Hughes和Rando，2014）。可以通过天然或交联染色质的部分核酸酶消化，然后连接介导的聚合酶链反应（LM-PCR）（McPherson等人，1993; Soutoglou）检测细胞或分离的核中的核小体位置和Talianidis，2002）。该方案描述了使用微球菌核酸酶（MNase）消化甲醛固定染色质，然后进行LM-PCR的核小体定位测定。我们举例说明了在小鼠中编码核糖体RNA（rRNA基因或rDNA）的基因启动子的核小体定位测定，其具有两个相互排斥的配置。 rDNA启动子含有相对于转录起始位点的核苷酸-157至-2或位于-132位的下游核小体（NucD ）的上游核小体（NucU ）至+22（Li等人，2006; Xie等人，2012）。 LM-PCR产物的放射性标记，然后变性尿素 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，允许两种配置的分辨和相对定量。如图1所示，核小体定位测定是通用的低至中等通量的方法，以半定量方式以高精度映射离散的核小体位置。
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