| Genomic Edition of Ashbya gossypii Using One-vector CRISPR/Cas9
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] The CRISPR/Cas9 system is a novel genetic tool which allows the precise manipulation of virtually any genomic sequence. In this protocol, we use a specific CRISPR/Cas9 system for the manipulation of Ashbya gossypii. The filamentous fungus A. gossypii is currently used for the industrial production of riboflavin (vitamina B2). In addition, A. gossypii produces other high-value compounds such as folic acid, nucleosides and biolipids. A large molecular toolbox is available for the genomic manipulation of this fungus including gene targeting methods, rapid assembly of ...
[摘要] [摘要] CRISPR/Cas9系统是一种新的基因工具，可以精确地操作几乎所有的基因组序列。在这个协议中，我们使用一个特定的CRISPR/Cas9系统来操纵棉蚜。丝状真菌A.gossypii目前用于核黄素（vitamina B2）的工业生产。此外，棉蚜还产生其他高价值化合物，如叶酸、核苷和生物脂类。一个大型的分子工具箱可用于该真菌的基因组操作，包括基因靶向方法、异源表达模块的快速组装，以及最近一个适用于棉铃虫的单载体CRISPR/Cas9编辑系统，该系统允许实施无标记工程策略。CRISPR/Cas9系统包括RNA引导的DNA内切酶（Cas9）和与基因组靶区互补的引导RNA（gRNA）。Cas9核酸酶需要5′-NGG-3′三核苷酸，称为原间隔基序（PAM），在基因组靶区产生一个双链断裂（DSB），该断裂可以通过同源重组（HR）由合成的致突变供体DNA（dDNA）修复，从而引入一个特定的设计突变。适用于棉铃虫的CRISPR/Cas9系统极大地促进了这种工业真菌的基因组编辑。
[背景] ...
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| Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) for Studying Sarcomeric Protein Interactions in Drosophila
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Protein-protein interactions in Drosophila myofibrils are essential for their function and formation. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an effective method for studying protein interactions and localization. BiFC relies on the reconstitution of a monomeric fluorescent protein from two half-fragments when in proximity. Two proteins tagged with the different half-fragments emit a fluorescent signal when they are in physical contact, thus revealing a protein interaction and its spatial distribution. Because myofibrils are large networks of interconnected proteins, BIFC ...
[摘要] [摘要] 果蝇肌原纤维中的蛋白质-蛋白质相互作用对其功能和形成至关重要。双分子荧光互补（BiFC ）是研究蛋白质相互作用和定位的一种有效方法。BiFC 依赖于邻近时从两个半片段重构单体荧光蛋白。标记有不同半片段的两种蛋白质在物理接触时会发出荧光信号，从而揭示了蛋白质相互作用及其空间分布。因为肌原纤维相互连接的蛋白质的大型网络中，附设是一种理想的方法来 研究肌原纤维中蛋白质之间的相互作用。在这里，我们提出了一种生成与BiFC 兼容的转基因果蝇的协议，以及一种基于肌原纤维中荧光BiFC 信号的蛋白质-蛋白质相互作用分析方法。我们的方案适用于大多数果蝇蛋白，只需稍加修改即可用于研究任何组织。
[背景] 肉瘤是横纹肌中最小的收缩单位，并沿着肌原纤维的长度以重复的方式延伸（Reedy和Beall，1993）。肉瘤产生肌肉收缩的能力取决于两个肌原纤维成分：细丝和粗丝。肌球蛋白粗丝固定在肌节中心的M线，而肌动蛋白细丝固定在肌节两侧的Z盘上。因此，Z盘对于维持肌原纤维的结构和收缩至关重要，而Z盘无法形成可能导致各种人类肌病的严重缺陷性肌肉表型（Lemke和Schnorrer，2017年）。
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| Generating Loss-of-function iPSC Lines with Combined CRISPR Indel Formation and Reprogramming from Human Fibroblasts
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] For both disease and basic science research, loss-of-function (LOF) mutations are vitally important. Herein, we provide a simple stream-lined protocol for generating LOF iPSC lines that circumvents the technical challenges of traditional gene-editing and cloning of established iPSC lines by combining the introduction of the CRISPR vector concurrently with episomal reprogramming plasmids into fibroblasts. Our experiments have produced nearly even numbers of all 3 genotypes in autosomal genes. In addition, we provide a detailed approach for maintaining and genotyping 96-well plates of iPSC ...
[摘要] 对于疾病和基础科学研究而言，功能丧失（LOF）突变是非常重要的。 在这里，我们提供了一个简单的流线化协议来产生LOF iPSC系列，通过将CRISPR载体与附加型重编程质粒同时引入成纤维细胞，规避了传统基因编辑和已建立的iPSC系的克隆的技术挑战。 我们的实验已经产生了常染色体基因中所有3种基因型的几乎偶数。 此外，我们提供了一个详细的方法来维护和iPSC克隆的96孔板的基因分型。
【背景】CRISPR / Cas9技术允许简单且特异地针对特定基因组位置进行基因编辑。将该技术与诱导性多能干细胞（iPSC）的疾病建模和再生医学潜力相结合将继续对生物医学研究产生前所未有的影响。然而，使CRISPR / Cas9系统适应iPSC已经提出了几个挑战。在细胞系中进行基因编辑的传统方法是用表达Cas9蛋白质的质粒和指导RNA（gRNA）转染细胞，然后产生单克隆并筛选所需的遗传改变。不幸的是，iPSC不适用于单细胞克隆。已经开发了几种补充媒介和克隆方法来克服这一困难，但仍然充满昂贵的设备（低氧培养箱），困难的技术步骤（FACS分选的单个iPSC的存活）或劳动密集型方案（亚克隆）（Forsyth ，2006; Miyaoka ...
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