| In vitro NLK Kinase Assay
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions to perform an in vitro kinase assay for nemo-like kinase. In addition, this protocol also describes an efficient method using mild lysis buffer for expression and purification of Glutathione S-transferase (GST) fusion proteins.
[摘要] 该协议提供了一步一步的指导，以进行nemo样激酶的体外激酶测定。 此外，该方案还描述了使用温和裂解缓冲液来表达和纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白的有效方法。
【背景】果蝇nemo已经被确定为在发育中的果蝇眼中光感受器簇的关键调节剂（Choi和Benzer，1994）。 据报道，nemo是不同物种间保守的。 该哺乳动物同系物是类似于Nemo的激酶（NLK）（Brott等人，1998; Rocheleau等人，1999）。 NLK是CMGC集团（CDK，MAPK，GSK3和CLK）的成员，也属于非典型的MAPK家族。 NLK通过转录因子调节多种细胞机制，所述转录因子包括在不同信号传导途径中的关键参与者TCF / LEF1，NICD和FOXO（Ishitani等人，1999; Ishitani等人， ，2010; Kim等人，2010）。 此外，最近我们已经将NLK鉴定为Yes相关蛋白（YAP）的新型激酶，YAP是Hippo途径中的共转录激活剂（Moon等人，2017）。 该协议描述了用于测量类似尼莫地来激酶活性的体外方法。
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| Extraction and Molybdenum Blue-based Quantification of Total Phosphate and Polyphosphate in Parachlorella
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Inorganic phosphorus is a non-renewable resource and an essential element for life on Earth. Organisms such as algae, protists, and animals can store phosphate (Pi) through uptake of Pi as polyphosphate (poly-P), which is a linear polymer of orthophosphate residues linked by high-energy phosphoanhydride bonds. Here, we describe procedures for extraction of total phosphate and poly-P from Parachlorella cells and quantification of orthophosphate based on molybdenum blue assay. The present method may be applicable for other microalgae.
[摘要] 无机磷是一种不可再生资源，是地球上生命的基本要素。 诸如藻类，原生生物和动物之类的生物体可以通过摄取作为多磷酸（poly-P）的Pi来储存磷酸盐（poly-P），聚磷酸盐是通过高能量磷酸酐键连接的正磷酸盐残基的线性聚合物。 在这里，我们描述了从Parachlorella细胞中提取总磷酸盐和poly-P以及基于钼蓝测定定量正磷酸盐的方法。 本方法可适用于其他微藻类。
【背景】生物磷回收是一种特别有吸引力的营养物回收形式。 藻类可以积聚磷酸盐（Pi），并且富含Pi的藻类生物质可用作生物肥料（Solovchenko等，2016）。 在以前的研究中，Ota等人 （2016）揭示了Parachlorella kessleri中硫缺乏（-S）条件下的电子密实体与聚P动力学的关系。 伞藻属于Trebouxiophyceae属的绿藻属，其特征在于刚性细胞壁和无性，不运动的生命周期。 这里提出的方案允许从小球藻提取总Pi和多磷酸（poly-P），并且基于钼蓝反应定量无机磷，这是用于定量正磷酸盐的标准方法。 Nagul等人先前回顾了钼蓝反应的理论背景。（2015年）。
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| Targeted Mutagenesis Using RNA-guided Endonucleases in Mosses
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] RNA-guided endonucleases (RGENs) have been used for genome editing in various organisms. Here, we demonstrate a simple method for performing targeted mutagenesis and genotyping in a model moss species, Physcomitrella patens, using RGENs. We also performed targeted mutagenesis in a non-model moss, Scopelophilla cataractae, using a similar method (Nomura et al., 2016), indicating that this experimental system could be applied to a wide range of mosses species.
[摘要] RNA引导的核酸内切酶（RGENs）已被用于各种生物体的基因组编辑。 在这里，我们展示了使用RGENs在模型苔藓种类小立碗藓中进行定向诱变和基因分型的简单方法。 我们还使用类似的方法（Nomura等，2016）在非模型苔藓，Scopelophilla白内障中进行了定向诱变，表明该实验系统可以应用于广泛的苔藓物种。
【背景】使用来自适应性免疫系统的RNA引导内切核酸酶（RGEN）的靶向诱变，使用细菌CRISPR（定期间隔的回文重复序列）/ Cas（CRISPR相关）系统近年来已经急剧发展。在该方法中，使用源自化脓性链球菌的Cas9核酸内切酶和人工设计的单链导向RNA（sgRNA）。 Cas9-sgRNA复合物识别原始相邻基序（5'-NGG-3'），并在目标位点上游3 bp切割（Jinek等，2012）。随后，在DNA的双链断裂（DSB）修复过程中发生随机插入和/或缺失突变。使用这些RGEN的定向诱变是有效的以及成本和时间有效的，它已被用于各种生物体（包括许多植物物种）的基因组编辑。在这里，我们在青苔中建立了使用RGEN进行靶向诱变的方案，并在模型和非模型物种中进行了证明（Nomura等，2016）。
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