| Multiplex T-cell Stimulation Assay Utilizing a T-cell Activation Reporter-based Detection System
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Immune tolerance and response are both largely driven by the interactions between the major histocompatibility complex (MHC) expressed by antigen presenting cells (APCs), T-cell receptors (TCRs) on T-cells, and their cognate antigens. Disordered interactions cause the pathogenesis of autoimmune diseases such as type 1 diabetes. Therefore, the identification of antigenic epitopes of autoreactive T-cells leads to important advances in therapeutics and biomarkers. Next-generation sequencing methods allow for the rapid identification of thousands of TCR clonotypes from single T-cells, and thus ...
[摘要] [摘要] 免疫耐受和应答都很大程度上由抗原呈递细胞（APC）表达的主要组织相容性复合物（MHC），T细胞上的T细胞受体（TCR）及其同源抗原之间的相互作用驱动。相互作用障碍导致自身免疫性疾病（例如1型糖尿病）的发病机理。因此，鉴定自身反应性T细胞的抗原表位导致治疗和生物标志物的重要进展。下一代测序方法可从单个T细胞快速鉴定数千种TCR克隆型，因此需要确定已鉴定TCR的同源抗原。该协议描述了T细胞活化的报告系统，其中荧光报告蛋白ZsGreen-1由活化T细胞的核因子（NFAT）信号驱动并通过流式细胞仪读取。记者T细胞也组成性表达额外的一对荧光素tein作为识别物，允许同时多路复用多达8种不同的报告T细胞系，每种表达不同的目标TCR，可通过流式细胞仪区分。一旦制成TCR表达细胞系，仅需一个转导步骤即可将其无限期用于制备新的T细胞系。这种多路复用系统允许筛选TCR-抗原相互作用的数量，否则这些相互作用将是不切实际的，可在多种情况下使用（即，筛选单个抗原或抗原库），并可用于研究任何T细胞-MHC-抗原三分子相互作用。
[背景] T细胞，抗原呈递细胞（APC）及其同源抗原之间的相互作用是自身免疫性疾病（例如1型糖尿病）的主要事件（Michels等，2017； ...
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| Ectopic Gene Expression in Macrophages Using in vitro Transcribed mRNA
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Macrophages are immune cells that contribute to host defense through various mechanisms including phagocytosis and antigen presentation. Their antimicrobial capacity is subverted by clinically important intracellular pathogens such as Mycobacterium tuberculosis. The study of host-pathogen interactions using these cells is therefore of considerable interest. Such studies often seek to express tagged proteins to characterize their activities, localizations, and protein-protein interactions. Here, we describe a robust method for transient protein expression in macrophages using mRNA ...
[摘要] 巨噬细胞是通过包括吞噬作用和抗原呈递在内的多种机制促成宿主防御的免疫细胞。 它们的抗菌能力被临床上重要的细胞内病原体诸如结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）所破坏。 因此使用这些细胞进行宿主 - 病原体相互作用的研究具有相当大的意义。 这样的研究通常试图表达标记的蛋白质来表征它们的活性，定位和蛋白质 - 蛋白质相互作用。 在这里，我们描述了使用mRNA脂质复合物转染在巨噬细胞中瞬时蛋白质表达的稳健方法。
【背景】典型的实现蛋白质表达的方法，包括使用阳离子聚合物转染DNA，核转染和病毒转导（Zhang等人，2009）在巨噬细胞中特别困难，因为这些细胞具有对 各种危险信号如胞质DNA。 因此，用于外源基因递送的常规方法导致差的转染效率和细胞死亡。 我们推论，正如最近的报道（Van De Parre等人，2004; McLenachan等人，2004）所述，转染mRNA而不是DNA，将是实现巨噬细胞中蛋白质表达的更好的替代方案 。，2013）。 我们能够实现高转染效率而不损失巨噬细胞活力（Koster等人，2017）。 我们的方法不需要昂贵的设备，可以适应表达外源性和内源性蛋白质。
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| A Method to Convert mRNA into a Guide RNA (gRNA) Library without Requiring Previous Bioinformatics Knowledge of the Organism
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] While the diversity of species represents a diversity of special biological abilities, many of the genes that encode those special abilities in a variety of species are untouched, leaving an untapped gold mine of genetic information; however, despite current advances in genome bioinformatics, annotation of that genetic information is incomplete in most species, except for well-established model organisms, such as human, mouse, or yeast. A guide RNA (gRNA) library using the clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 (CRISPR-associated protein 9) system can be used for ...
[摘要] 虽然物种的多样性代表着特殊的生物学能力的多样性，但许多编码这些特殊能力的基因却是不变的，留下了未开发的遗传信息金矿;然而，尽管基因组生物信息学方面取得了进展，但除了成熟的模型生物体，如人，小鼠或酵母，遗传信息的注释在大多数物种中是不完全的。使用聚簇常规散布的回文重复序列（CRISPR）/ Cas9（CRISPR相关蛋白9）系统的引导RNA（gRNA）文库可用于通过正向遗传学对非特异性基因的表型筛选。 gRNA文库的构建通常需要从注释基因设计的大量化学合成寡核苷酸;如果想在没有目标DNA序列的先验知识的情况下将mRNA转换成gRNA，那么主要的挑战就是发现原始邻近基序（PAM）侧翼的序列并切出20-bp片段。最近，我开发了基于分子生物学技术将mRNA转化为gRNA文库（Arakawa，2016）（图1）。我在这里描述了如何从mRNA构建gRNA文库的详细协议。
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图1.将mRNA转化为gRNA文库构建的方法（Sanjana等人，2014）。总结了该方法的方案。在步骤中详细描述了D-O的每个步骤。 ...
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