| Oral Microbiome Characterization in Murine Models
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] The oral microbiome has been implicated as a trigger for immune responsiveness in the oral cavity, particularly in the setting of the inflammatory disease periodontitis. The protocol presented here is aimed at characterizing the oral microbiome in murine models at steady state and during perturbations of immunity or physiology. Herein, we describe murine oral microbiome sampling procedures, processing of low biomass samples and subsequent microbiome characterization based on 16S rRNA gene sequencing.
[摘要] 口腔微生物组被认为是口腔免疫应答的触发因素，特别是在炎性疾病牙周炎的形成中。 这里提出的协议旨在描述在稳定状态和扰动免疫或生理学的小鼠模型中的口腔微生物群。 在此，我们描述了鼠类口腔微生物群落取样程序，低生物量样品的处理和随后的基于16S rRNA基因测序的微生物群鉴定。
【背景】微生物组在调节组织特异性免疫应答（特别是在屏障部位）中起关键作用（Belkaid和Harrison，2017）。在这些屏障环境中，例如胃肠道和皮肤，选择的共生物显示能够驱动特定免疫细胞群体的发育（Ivanov等人，2009; Naik等人。，2012）。我们的工作最近开始探索口腔微生物组在剪裁组织免疫力方面的影响，尤其是在牙龈处，一个脆弱的口腔屏障部位（Abusleme和Moutsopoulos，2016; Dutzan等人，2017）。
在人类中，众所周知口腔中含有丰富多样的微生物（Human Microbiome Project，2012）。口腔微生物群落的改变与常见的口腔疾病，牙周炎（一种影响牙龈组织并导致组织损伤的炎症）有关（Griffen等人，2012; Abusleme等人。，2013; Moutsopoulos et al 。，2015）。迄今为止，动物模型已经有助于解决微生物组在各种生理和病理条件中的作用（Turnbaugh等人，2006; ...
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| Dense sgRNA Library Construction Using a Molecular Chipper Approach
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Genetic screens using single-guide-RNA (sgRNA) libraries and CRISPR technology have been powerful to identify genetic regulators for both coding and noncoding regions of the genome. Interrogating functional elements in noncoding regions requires sgRNA libraries that are densely covering, and ideally inexpensive, easy to implement and flexible for customization. We present a Molecular Chipper protocol for generating dense sgRNA libraries from genomic regions of interest. This approach utilizes a combination of random fragmentation and a Type III restriction enzyme to derive a dense coverage of ...
[摘要] 使用单导向RNA（sgRNA）文库和CRISPR技术的遗传筛选功能强大可以识别基因组编码区和非编码区的遗传调控因子。 在非编码区域中询问功能元件需要密集覆盖的sgRNA文库，理想的便宜，易于实现和灵活定制。 我们提出了一个分子切片方案从感兴趣的基因组区域产生密集的sgRNA文库。 该方法利用随机断裂和III型限制酶的组合从输入DNA导出sgRNA文库的致密覆盖。
【背景】使用化脓性链球菌（sp）的基因组编辑Cas9和sgRNA文库是通过产生双重缺失功能序列改变来筛选哺乳动物细胞功能性遗传调节因子的有力工具（Wiedenheft et al。，2012; Mali et al。，2013; Koike-Yusa等，2014; Shalem等，2014; Wang等，2014; Zhou等，2014）。 Cas9结合sgRNA，其可被设计为将Cas9靶向基因组中定义的基因座。 Cas9的核酸酶活性切割靶DNA位点，导致双链DNA断裂，在通过非同源末端连接途径进行DNA修复时，经常导致感兴趣的基因座短缺失。
CRISPR-Cas9系统强大的基因组编辑能力导致使用sgRNA文库来询问蛋白质编码基因以及非编码区域。通过sgRNA富集功能筛选，报告了几种用于蛋白质编码基因和/或有限数量的非编码基因的sgRNA文库，以鉴定调控特定细胞功能的基因和网络（Koike-Yusa等，2014; ...
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| Chromatin Immunoprecipitation Experiments from Whole Drosophila Embryos or Larval Imaginal Discs
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Chromatin Immunoprecipitation coupled either to qPCR (qChIP) or high-throughput sequencing (ChIP-Seq) has been extensively used in the last decades to identify the DNA binding sites of transcription factors or the localization of various histone marks along the genome. The ChIP experiment generally includes 7 steps: collection of biological samples (A), cross-linking proteins to DNA (B), chromatin isolation and fragmentation by sonication (C), sonication test (D), immunoprecipitation with antibodies against the protein or the histone mark of interest (E), DNA recovery (E), identification of ...
[摘要] 与qPCR（qChIP）或高通量测序（ChIP-Seq）相结合的染色质免疫沉淀已被广泛用于识别转录因子的DNA结合位点或基因组中各种组蛋白标记的定位。 ChIP实验通常包括7个步骤：收集生物样品（A），交联蛋白质到DNA（B），染色质分离和通过超声处理分离（C），超声处理测试（D），用针对蛋白质的抗体进行免疫沉淀感兴趣的组蛋白标记（E），DNA回收（E），通过PCR或测序鉴定因子相关DNA序列（F）。这里描述的协议可以容易地用于ChIP-seq和ChIP-qPCR实验。描述在完整的果蝇组织中优化分析的实验设置条件的整个过程可以在四天内完成。
背景 尽管永生化的培养细胞广泛用于研究各种细胞类型的染色质景观，但是在生理条件下在体内探测相互作用的有价值的方法对于进行转录的时间或空间比较分析是必要的因子和组蛋白修饰图在不同阶段的果蝇发展或不同组织之间。在这里，我们提供了一个详细的ChIP协议，已被优化，以便在整个果蝇胚胎和幼虫成像光盘上工作，突出关键的实验参数。
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