| Analysis of Pseudomonas aeruginosa c-di-GMP High and Low Subpopulations Using Flow-assisted Cell Sorting (FACS) and Quantitative Reverse Transcriptase PCR (qRT-PCR)
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Cyclic diguanylate monophosphate (c-di-GMP) is a second messenger signaling molecule that drives the transition from planktonic to the biofilm mode of growth in many bacterial species. Pseudomonas aeruginosa has at least two surface sensing systems that produce c-di-GMP in response to surface attachment, the Wsp and Pil-Chp systems. We recently used a plasmid-based c-di-GMP reporter (pPcdrA::gfp) to describe how the Wsp system generates heterogeneity in surface sensing, resulting in two physiologically distinct subpopulations of cells during early biofilm formation. One subpopulation has ...
[摘要] [摘要]环状双鸟苷酸单磷酸酯（c-di-GMP）是第二个信使信号分子，它驱动许多细菌物种从浮游生物向生物膜生长的转变。铜绿假单胞菌具有至少两个响应于表面附着而产生c-di-GMP的表面传感系统，即Wsp和Pil-Chp系统。我们最近使用了基于质粒的c-di-GMP报告基因（pP cdrA :: gfp ）描述Wsp系统如何在表面感应中产生异质性，从而在早期生物膜形成过程中导致两个生理上不同的细胞亚群。一个亚群的c-di-GMP升高并产生生物膜基质，从而成为最初的微殖民地的奠基人。另一个亚群的c-di-GMP较低，并且具有表面运动性，可以探索表面。在这里，我们描述了一项关键实验的协议，以确认我们在表面传感过程中对c-di-GMP异质性的初步观察：使用流辅助细胞分选（FACS）来分离具有高和低c- di- G的细胞亚群GMP报告基因活性，然后是已知响应于细胞c-di-GMP水平（pelA和pslA ）被转录调控的基因的定量逆转录酶PCR（qRT-PCR ）。该方案可以被其他人修改以分离高c-di-GMP铜绿假单胞菌细胞的亚群，这些亚群在基因上是相同的，但在表型上是不同的，以便将来像我们一样检查特定的mRNA转录本，或者大概用于其他应用如RNAseq，蛋白质组学或TNseq。
图形概要：
[背景]第二信使信号分子环状单鸟苷酸单磷酸酯（c-di-GMP）可使细菌响应环境条件而迅速修饰其细胞表面。双鸟苷酸环化酶（DGC）是含有从两个GTP分子合成c-di-GMP的GGDEF氨基酸序列基序的蛋白质，磷酸二酯酶（PDE）是具有EAL或HD-GYP基序的蛋白，可将c-di-GMP水解为线性pGpG或GMP ...
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| Quantification of Hydrogen Sulfide and Cysteine Excreted by Bacterial Cells
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Bacteria release cysteine to moderate the size of their intracellular pools. They can also evolve hydrogen sulfide, either through dissimilatory reduction of oxidized forms of sulfur or through the deliberate or inadvertent degradation of intracellular cysteine. These processes can have important consequences upon microbial communities, because excreted cysteine autoxidizes to generate hydrogen peroxide, and hydrogen sulfide is a potentially toxic species that can block aerobic respiration by inhibiting cytochrome oxidases. Lead acetate strips can be used to obtain semiquantitative data of ...
[摘要] 细菌释放半胱氨酸以调节细胞内池的大小。它们也可以通过硫的氧化形式的异化还原或通过细胞内半胱氨酸的故意或无意降解来释放硫化氢。这些过程会对微生物群落产生重要影响，因为排泄的半胱氨酸会自动氧化生成过氧化氢，而硫化氢是一种潜在的毒性物种，可通过抑制细胞色素氧化酶来阻断有氧呼吸。醋酸铅条可用于获得硫化物演化的半定量数据（Oguri et al。，2012）。在这里，我们描述的方法，允许更多的定量和歧视措施半胱氨酸和硫化氢释放细菌细胞。提供了一个说明性实例，其中当暴露于外源性胱氨酸时，大肠杆菌迅速产生半胱氨酸和硫化物（Chonoles Imlay等人，2015; Korshunov等人， ，2016）。
【背景】微生物通过几种途径产生了减少的硫物质。硫酸盐还原菌利用还原过程作为能量生成的组成部分。其他细菌释放硫化物，作为硫物质（包括半胱氨酸）的蓄意或偶然降解的副产物。我们观察到半胱氨酸本身是在细胞内水平异常高时排泄的，这种情况可能通过不受控制的氨基酸输入或半胱氨酸合成失调发生。这些硫物质具有非同寻常的反应性，因为它们以高亲和力与金属结合，也是与分子氧发生化学反应的少数生物分子之一。结果是减少的硫化合物可以对细胞产生重要影响。因此，跟踪各种情况下含硫化合物的动态变化是非常重要的。
硫醇试剂 - 特别是5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB） ...
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| Method for CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Candida albicans
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] Candida albicans is the most prevalent and important human fungal pathogen. The advent of CRISPR as a means of gene editing has greatly facilitated genetic analysis in C. albicans. Here, we describe a detailed step-by-step procedure to construct and analyze C. albicans deletion mutants. This protocol uses plasmids that allow simple ligation of synthetic duplex 23mer guide oligodeoxynucleotides for high copy gRNA expression in C. albicans strains that express codon-optimized Cas9. This protocol allows isolation and characterization of deletion strains within ...
[摘要] 白色念珠菌是最普遍和最重要的人类真菌病原体。 CRISPR作为基因编辑手段的出现极大地促进了 C中的遗传分析。白色假丝酵母。 在这里，我们描述一个详细的分步过程来构建和分析 C。 白色念珠菌缺失突变体。 该协议使用质粒，允许合成的双链体23mer引导寡聚脱氧核苷酸在高拷贝gRNA表达的简单连接。 表达密码子优化的Cas9的白色念珠菌菌株。 该协议允许在9天内分离和鉴定缺失菌株。
【背景】℃。白色念珠菌是一种难以处理遗传的有机体。由于它通常作为不容易进行有性生殖的二倍体存在，所以纯合隐性突变需要对每个基因座进行连续修饰。克隆间规则间隔短回文重复（CRISPR）突变的发展和应用。白色念珠菌促进遗传操作，因为它允许两个等位基因同时突变（Vyas et al。，2015; Min et al。，2016; Ng and Dean，2017 ）。 CRISPR基因编辑涉及将RNA引导的核酸酶募集至邻近NGG原型间隔子邻接基序（PAM）的互补靶位点（Jinek等人，2012; Cong等人， 2013年;马里等人，2013年）。 CRISPR相关（Cas）核酸酶通过与结合Cas9的激活CRISPR RNA（tracrRNA）相关的指导RNA之间的互补碱基配对以高特异性进行靶向（Gasiunas等人， ...
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