| Ciliary Assembly/Disassembly Assay in Non-transformed Cell Lines
|
|
Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The primary cilium is a non-motile sensory organelle whose assembly and disassembly are closely associated with cell cycle progression. The primary cilium is elongated from the basal body in quiescent cells and is resorbed as the cells re-enter the cell cycle. Dysregulation of ciliary dynamics has been linked with ciliopathies and other human diseases. The in vitro serum-stimulated ciliary assembly/disassembly assay has gained popularity in addressing the functions of the protein-of-interest in ciliary dynamics. Here, we describe a well-tested protocol for transfecting human retinal ...
[摘要] 主要纤毛是一种非运动感觉细胞器，其装配和拆卸与细胞周期进程密切相关。 初级纤毛在静止细胞中从基体拉长并随着细胞重新进入细胞周期而被吸收。 睫状动力失调与纤毛病和其他人类疾病有关。 体外血清刺激的睫状体装配/分解测定已经在解决睫状动力学中感兴趣的蛋白质的功能方面受到欢迎。 在这里，我们描述了转染人视网膜色素上皮细胞（RPE-1）和对转染细胞进行睫状体装配/分解测定的充分测试的方案。
【背景】初级纤毛是毛发样感觉细胞器，其在G 0 / G 1期出现，并且在细胞周期的S期之前分解（Tucker等， et al。，1979）。先前的研究已经证实，某些未转化的细胞类型（即，甚至是RPE-1细胞，3T3成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞[MEFs]）可以被饿死以诱导静止和睫状体形成。随后的血清再次添加触发双相睫状体吸收，其在刺激后2小时和24小时达到峰值（Tucker等人，1979; Li等人，2011） 。该现象为文献中常用的血清刺激的睫状体组装/分解测定奠定了基础，以鉴定参与睫状体组装和拆卸的蛋白质（Pugacheva等人，2007; ...
|
|
|
| Extraction and Molybdenum Blue-based Quantification of Total Phosphate and Polyphosphate in Parachlorella
|
|
Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Inorganic phosphorus is a non-renewable resource and an essential element for life on Earth. Organisms such as algae, protists, and animals can store phosphate (Pi) through uptake of Pi as polyphosphate (poly-P), which is a linear polymer of orthophosphate residues linked by high-energy phosphoanhydride bonds. Here, we describe procedures for extraction of total phosphate and poly-P from Parachlorella cells and quantification of orthophosphate based on molybdenum blue assay. The present method may be applicable for other microalgae.
[摘要] 无机磷是一种不可再生资源，是地球上生命的基本要素。 诸如藻类，原生生物和动物之类的生物体可以通过摄取作为多磷酸（poly-P）的Pi来储存磷酸盐（poly-P），聚磷酸盐是通过高能量磷酸酐键连接的正磷酸盐残基的线性聚合物。 在这里，我们描述了从Parachlorella细胞中提取总磷酸盐和poly-P以及基于钼蓝测定定量正磷酸盐的方法。 本方法可适用于其他微藻类。
【背景】生物磷回收是一种特别有吸引力的营养物回收形式。 藻类可以积聚磷酸盐（Pi），并且富含Pi的藻类生物质可用作生物肥料（Solovchenko等，2016）。 在以前的研究中，Ota等人 （2016）揭示了Parachlorella kessleri中硫缺乏（-S）条件下的电子密实体与聚P动力学的关系。 伞藻属于Trebouxiophyceae属的绿藻属，其特征在于刚性细胞壁和无性，不运动的生命周期。 这里提出的方案允许从小球藻提取总Pi和多磷酸（poly-P），并且基于钼蓝反应定量无机磷，这是用于定量正磷酸盐的标准方法。 Nagul等人先前回顾了钼蓝反应的理论背景。（2015年）。
|
|
|
| Targeted Mutagenesis Using RNA-guided Endonucleases in Mosses
|
|
Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] RNA-guided endonucleases (RGENs) have been used for genome editing in various organisms. Here, we demonstrate a simple method for performing targeted mutagenesis and genotyping in a model moss species, Physcomitrella patens, using RGENs. We also performed targeted mutagenesis in a non-model moss, Scopelophilla cataractae, using a similar method (Nomura et al., 2016), indicating that this experimental system could be applied to a wide range of mosses species.
[摘要] RNA引导的核酸内切酶（RGENs）已被用于各种生物体的基因组编辑。 在这里，我们展示了使用RGENs在模型苔藓种类小立碗藓中进行定向诱变和基因分型的简单方法。 我们还使用类似的方法（Nomura等，2016）在非模型苔藓，Scopelophilla白内障中进行了定向诱变，表明该实验系统可以应用于广泛的苔藓物种。
【背景】使用来自适应性免疫系统的RNA引导内切核酸酶（RGEN）的靶向诱变，使用细菌CRISPR（定期间隔的回文重复序列）/ Cas（CRISPR相关）系统近年来已经急剧发展。在该方法中，使用源自化脓性链球菌的Cas9核酸内切酶和人工设计的单链导向RNA（sgRNA）。 Cas9-sgRNA复合物识别原始相邻基序（5'-NGG-3'），并在目标位点上游3 bp切割（Jinek等，2012）。随后，在DNA的双链断裂（DSB）修复过程中发生随机插入和/或缺失突变。使用这些RGEN的定向诱变是有效的以及成本和时间有效的，它已被用于各种生物体（包括许多植物物种）的基因组编辑。在这里，我们在青苔中建立了使用RGEN进行靶向诱变的方案，并在模型和非模型物种中进行了证明（Nomura等，2016）。
|
|
|