| Polyamine Transport Assay Using Reconstituted Yeast Membranes
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] ATP13A2/PARK9 is a late endo-/lysosomal P5B transport ATPase that is associated with several neurodegenerative disorders. We recently characterized ATP13A2 as a lysosomal polyamine exporter, which sheds light on the molecular identity of the unknown mammalian polyamine transport system. Here, we describe step by step a protocol to measure radiolabeled polyamine transport in reconstituted vesicles from yeast cells overexpressing human ATP13A2. This protocol was developed as part of our recent publication (van Veen et al., 2020) and will be useful for characterizing the transport function of ...
[摘要] [摘要] ATP13A2 / PARK9是一种晚期内/溶酶体P5B转运ATPase，与多种神经退行性疾病有关。我们最近将ATP13A2表征为溶酶体多胺出口者，这为未知的哺乳动物多胺转运系统的分子身份提供了线索。在这里，我们逐步描述了从过量表达人ATP13A2的酵母细胞中测量重组囊泡中放射性标记的多胺转运的方案。该方案是我们最新出版物的一部分（van Veen等，2020），将有助于表征其他假定的多胺转运蛋白的转运功能，例如P5B转运ATPase的同工型。
[背景] ATP13A2 / PARK9编码一种普遍表达的晚期内-/溶酶体膜蛋白，与一系列神经退行性疾病有关，例如早发性帕金森氏病（Di Fonzo等，2007 ；Lin等，2008）和Kufor -Rakeb综合征（伴痴呆的早期帕金森病）（Ramirez等，2006 ；Park等，2011）。ATP13A2属于P型转运ATPase ，是一类活性转运蛋白，由于ATP水解而暂时形成磷酸中间产物（Kuhlbrandt ，2004年）。ATP13A2是P5亚家族的成员，该家族已在20多年前通过基因组测序鉴定出来（Axelsen和Palmgren ...
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| Cell-free Generation of COPII-coated Procollagen I Carriers
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The aim of this protocol is to generate COPII-coated procollagen I (PC1) carriers in a cell-free reaction. The COPII-coated PC1 carriers were reconstituted from donor membrane, cytosol, purified recombinant COPII proteins, and nucleotides. This protocol describes the preparation of donor membrane and cytosol, the assembly of the reaction, and the isolation and detection of reconstituted COPII-coated carriers. This cell-free reaction can be used to test conditions that stimulate or suppress the packaging of PC1 into COPII-coated carriers.
[摘要] 该协议的目的是在无细胞反应中产生COPII包被的前胶原I（PC1）载体。 COPII包被的PC1载体由供体膜，胞质溶胶，纯化的重组COPII蛋白和核苷酸重构。 该方案描述了供体膜和细胞溶胶的制备，反应的组装，以及复制的COPII包被的载体的分离和检测。 该无细胞反应可用于测试刺激或抑制PC1包装成COPII包被的载体的条件。
【背景】外壳蛋白复合体II（COPII）在从内质网（ER）途径到高尔基体的运输中起着至关重要的作用。来自ER的货物运输所需的基因在酵母的基因研究中被发现，并且借助于添加有纯化组分的无细胞囊泡萌芽反应来阐明囊泡出芽所需基因的蛋白质产物的精确作用（Novick 1981; Kaiser等人，1990; Barlowe等人，1994）。开发了类似的反应来检测COPII在培养的哺乳动物细胞中来自ER的货物运输中的作用（Kim等人，2005）。哺乳动物COPII包被的囊泡直径大约为80-100nm，似乎太小以至于不能容纳诸如刚性的300nm前胶原I（PC1）三股螺旋杆的大分泌性货物。尽管可能的尺寸差异，COPII对于包括PC1在内的大型货物的分泌是必不可少的（Boyadjiev等人，2006）。最近，我们报道了通过随机光学重建显微镜（STORM），相关光电子显微镜（CLEM）和活细胞成像（Gorur ...
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| Fluorophore Labeling, Nanodisc Reconstitution and Single-molecule Observation of a G Protein-coupled Receptor
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Activation of G protein-coupled receptors (GPCRs) by agonist ligands is mediated by a transition from an inactive to active receptor conformation. We describe a novel single-molecule assay that monitors activation-linked conformational transitions in individual GPCR molecules in real-time. The receptor is site-specifically labeled with a Cy3 fluorescence probe at the end of trans-membrane helix 6 and reconstituted in phospholipid nanodiscs tethered to a microscope slide. Individual receptor molecules are then monitored over time by single-molecule total internal reflection fluorescence ...
[摘要] 通过激动剂配体激活G蛋白偶联受体（GPCR）是通过从无活性受体构象向活性受体构象的转变来介导的。我们描述了一种新颖的单分子测定法，可以实时监测单个GPCR分子中的激活连锁构象转换。受体在跨膜螺旋6末端用Cy3荧光探针进行位点特异性标记，并在连接到显微镜载玻片的磷脂纳米圆盘中重构。然后通过单分子全内反射荧光显微镜随时间监测单个受体分子，显示无活性和活性样构象之间的自发转变。该测定提供关于无活性和活性受体构象的平衡分布以及构象交换的速率常数的信息。实验可以在不存在配体的情况下进行，显示负责基础信号传导活动的自发构象过渡，或者存在激动剂或反向激动剂配体，揭示配体如何改变受体的动力学刺激或抑制信号传导活性。所得到的机械信息对于改进的GPCR靶向药物的设计是有用的。单分子测定法在β2肾上腺素能受体的背景下进行了描述，但可扩展到多种GPCRs。
【背景】GPCR介导本地和远距离的细胞通讯，特别是内分泌系统。例如，细胞对激素如肾上腺素的反应是通过肾上腺素能受体介导的，其中β2肾上腺素能受体（β2AR）是突出的成员。 ...
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