| In vitro RNA-dependent RNA Polymerase Assay Using Arabidopsis RDR6
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) in eukaryotes convert single-stranded RNAs into double-stranded RNAs, thereby amplifying small interfering RNAs that play crucial roles in the regulation of development, maintenance of genome integrity and antiviral immunity. Here, we describe a method of in vitro RdRP assay using recombinant Arabidopsis RDR6 prepared by an insect expression system. By using this classical biochemical assay, we revealed that RDR6 has a strong template preference for RNAs lacking a poly(A) tail. This simple method will be applicable to other RdRPs in Arabidopsis ...
[摘要] 真核生物中的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）将单链RNA转化为双链RNA，从而扩增在调节发育，维持基因组完整性和抗病毒免疫方面起关键作用的小干扰RNA。 在此，我们描述了使用通过昆虫表达系统制备的重组拟南芥RDR6的体外RdRP测定的方法。 通过使用这种经典的生物化学分析，我们发现RDR6有一个强大的模板偏好RNAs缺乏poly（A）尾巴。 这个简单的方法将适用于拟南芥属和其他生物体中的其他RdRPs。
【背景】已经在所有真核生物王国 - 植物，真菌，原生动物和动物中发现RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）基因（Zong等人，2009）。它们将单链RNA（ssRNA）转化为双链RNA（dsRNA），从而扩增在各种生物过程中发挥关键作用的小干扰RNA（siRNA），包括调节发育（Peragine等人， ，2004; Li等人，2005），维持基因组完整性（Volpe等人，2002; Xie等人，2004年， ）和抗病毒免疫性（Mourrain等人，2000; Yu等人，2003; Garcia-Ruiz等人，2010; Wang ，2010）。除了这种RdRP活性之外，RdRP还具有称为末端核苷酸转移酶（TNTase）活性的另一种酶活性（Curaba和Chen，2008; ...
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| RNA Capping by Transcription Initiation with Non-canonical Initiating Nucleotides (NCINs): Determination of Relative Efficiencies of Transcription Initiation with NCINs and NTPs
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] It recently has been established that adenine-containing cofactors, including nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), and 3’-desphospho-coenzyme A (dpCoA), can serve as ‘non-canonical initiating nucleotides’ (NCINs) for transcription initiation by bacterial and eukaryotic cellular RNA polymerases (RNAPs) and that the efficiency of the reaction is determined by promoter sequence (Bird et al., 2016). Here we describe a protocol to quantify the relative efficiencies of transcription initiation using an NCIN vs. transcription ...
[摘要] 最近已经确定，含有腺嘌呤的辅因子，包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +），还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和3'-脱磷酸辅酶A（dpCoA）可以作为“非规范起始核苷酸” NCIN），用于通过细菌和真核细胞RNA聚合酶（RNAP）进行转录起始，并且通过启动子序列确定反应的效率（Bird等，2016）。 在这里，我们描述了使用NCIN与使用三磷酸核苷（NTP）对于给定启动子序列的转录起始来定量转录起始的相对效率的方案。
【背景】在细菌，古细菌和真核生物中的转录由序列，结构和机制保守的多亚基RNA聚合酶（RNAPs）进行（Ebright，2000; Lane和Darst，2010）。为了启动转录，RNAP与一个或多个引发因子一起结合称为“启动子”的特异性DNA序列，并解开启动子DNA以形成含有未解链“转录泡”的RNAP启动子开放复合物（RPo）（图1A; Ruff等人，2015）。 RNAP然后通过扩增（“剔除”）或收缩（“抗锯齿”）转录起始点来选择转录起始位点，以将转录起始位点的核苷酸置于RNAP活性中心起始位点（“i位点”）和扩增位点'i + 1位点'）结合i位点的互补起始核苷酸底物和“i + 1”位点的互补延伸底物，并催化磷酸二酯键形成产生初始RNA产物（Winkelman等， 2016）。
在标准的从头转录启动中，起始底物是核苷三磷酸（NTP），通常为ATP或GTP（Nickels ...
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