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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] We previously reported that oxidized nucleotide insertion by DNA polymerase β (pol β) can confound the DNA ligation step during base excision repair (BER) (Çağlayan et al., 2017). Here, we describe a method to investigate pol β nucleotide insertion coupled with DNA ligation, in the same reaction mixture including dGTP or 8-oxo-dGTP, pol β and DNA ligase I. This in vitro assay enables us to measure the products for correct vs. oxidized nucleotide insertion, DNA ligation, and ligation failure, i.e., abortive ligation products, as a function of reaction time. This ...
[摘要] 我们以前报告说，通过DNA聚合酶β（polβ）的氧化的核苷酸插入可能会在碱基切除修复（BER）（Çağlayan等，2017）期间混淆DNA连接步骤。 在这里，我们描述了在与dGTP或8-氧代-dGTP，polβ和DNA连接酶I相同的反应混合物中研究与DNA连接相结合的polβ核苷酸插入的方法。该体外测定使得我们能够测量产物的正确性 与氧化核苷酸插入，DNA连接和连接失败，即流产结扎产物，作为反应时间的函数。 该协议补充了我们以前的出版物，并描述了一种有效的方法来分析BER酶的活性和polβ和DNA连接酶I在体外的功能相互作用。
【背景】该方案是观察BER路径的最后两个步骤：通过连接酶I通过polβ进行核苷酸插入和DNA连接。使用该方案，在体外在同一反应混合物中测量两种反应作为时间的函数。原始实体是在模拟BER中间体的单核苷酸缺口DNA底物上分析BER酶polβ和DNA连接酶I。这些BER酶与此BER中间体结合并起作用。该方案中使用的DNA底物包括在5'和3'端的荧光标记，使我们能够观察DNA底物的单核苷酸插入和DNA连接。与DNA连接偶联的polβ核苷酸插入模拟了切口DNA中间体从核苷酸插入步骤切换或引导到BER途径期间的连接步骤。使用该方案，也可以在polβ氧化的核苷酸（8-氧代-dGTP）插入后测量连接失败或者终止连接。这通过在BER中间体的5'-末端添加腺苷酸（AMP）基团进行定量来实现。该方案也可用于测量与其他DNA聚合酶和DNA连接酶连接的核苷酸插入。 ...
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